作者homer0331 (Homer)
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标题[求救] Real-time
时间Thu Nov 13 15:15:55 2008
最近做 real-time 有很多的问题
之前primer设计了很多次
专一性都会不太好
好不容易梯度都测好了
做普通ＰＣＲ看起来的都ＯＫ
但是做real 时候都会有很多条峰
而且负ctrl也会有 band
我是用Bio-Rad SYBR 总体积 25 :
包含 SYBR 12.5, H2O(nuclease free)6.5, primer 0.5(total conc. 200nm)
, template 5ul(用1ug RNA转)
还有我有时候会加betaine让ＰＣＲ好一点
这可以加入SYBR Green吗
另外一个问题就是图型的问题
如果同一sample和同样primer做出来的图
Ct值一样
但是过Ct 值後爬升的高度不一样
那是甚麽问题呢
最後就是做的时候
SYBR都会有很多泡泡
离也离不掉
但是都是在很上层
如果只有一个泡泡也会有差吗
大家都怎麽操作比较不会有泡泡
谢谢大家帮我解答
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※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 140.121.179.203
1F：推 zoom8080:跑完应该没泡泡 因为94 95度泡泡会破 11/13 16:24
2F：→ zoom8080:primer直接找paper会比较快，不过有时连paper的都有dimer 11/13 16:25
3F：→ zoom8080:template 5ul是每well 5ul吗? 11/13 16:27
4F：→ zoom8080:PCR看产物本来就有风险 因为副产物量不多肉眼看不见 11/13 16:28
5F：→ zoom8080:(指透过跑胶看不见) 11/13 16:29
6F：推 zoom8080:机器用哪一台? 11/13 16:34
7F：→ homer0331:iq cycler 11/13 21:31