作者wa478478 (俺真的不是王力宏)
看板Biotech
標題[求救] RNAi and protein 拜託各位了...
時間Thu Oct 30 18:02:21 2008
請問各位大大..
有沒有人針對細胞做RNAi之後..
做real time PCR 確定 mRNA的表現量有被抑制下來(效率大概80~90%)
但是做western卻沒有抑制下來的現象...
理論上不是蛋白質的表現量會下降嗎??...
可是看起來怎會沒有啥改變??
是我蛋白量用太多嗎??(小弟我蛋白跑50ug,大小21KD,跑15%的gel)
還是因為蛋白是膜蛋白,所以蛋白太穩定半生期太長嗎??
還是我使用的一抗專一性太差...
還是real time PCR 數據錯誤?
還是有其他因素?
對了,我所用的細胞是有抗生素挑過的stable colony...
應該不太是因為Cell不純所導致的...
還是有其他方法(就是不用western的方法)
可以確定蛋白的表現....
小弟已經為了這實驗已經糾纏了快一年了..
拜託各位大大了!!!
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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 140.128.143.99
1F：推 kirry:activity? 10/31 23:08
2F：推 Nikio:用RNAi你這問題常發生耶～你可以去基因體中心RNAi core 11/09 23:49
3F：→ Nikio:看看成果回報，其實很多你的例子，不過我還是覺得要 11/09 23:50
4F：→ Nikio:protein量下降比較讓人放心@@..... 11/09 23:50
5F：→ Nikio:還有～我的經驗，用RNAi最好是做早期的細胞株，通常養越久 11/09 23:51
6F：→ Nikio:knockdown效果越差～這是真的！本來有KNOCKDOWN 11/09 23:51
7F：→ Nikio:挑了stable clone又養了幾代～咦～怎麼跟CONTROL一樣了!驚! 11/09 23:52
8F：推 Nikio:不過前幾代通常還OK.....恩恩 互相交流一下 我最近也因為 11/09 23:56
9F：→ Nikio:RNAi konckdown效果頭大很久@..@ 11/09 23:57