作者violescent (看不清楚的眼睛..)
看板Biotech
標題[求救] 蛋白純化
時間Mon Oct 27 21:38:33 2008
小弟之前用GST tag表現一個蛋白質
表現量還不錯多 沒有inclusion body 但是它就是binding的效率非常差
beads完全是新的 我用的buffer 是PBS
我個人也有試過其它的buffer 包含Tris 加了一些detergent
然後 在破菌前也加了DTT final 濃度 5mM
到後來加了Urea 因為害怕把GST弄掛 所以只有加了一點點 大概0.5M~1M都有用過
我也check 過capacity 用另一個GST的蛋白來做control 發現不是capacity的問題
蛋白質binding的效率仍然非常差 (我也check過GST有接在蛋白上 有做過western)
所以我放棄GST 改用另一個system
我用了his-SUMO fusion 的system
使用的buffer是50 mM Tris pH 7.4 , wash用 300 mM NaCl 30mM imidazole
elute 用 300mM NaCl, 300mM imidazole
雖然我只有試了一次 但是我發現 它好像也不太binding 光用wash buffer就洗下來了
elute沒 什麼東東 flow through就一堆沒有bind
所以結果 好像也是不太bind到beads上
所以 有人有遇過像這樣不bind的問題嗎？ 我應該放棄用tag來純化嗎？！
改用一般其它離子交換、gel filtration、hydrophobic.....
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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 61.230.7.68
1F：推 borhen:首先妳蛋白質有卻定可以表現嗎 induction有做嗎 10/28 00:32
2F：→ borhen:有表現 理論上GST binding能力很強 別擔心 10/28 00:33
3F：→ borhen:囧 打錯了 妳好像表現亮不錯~@@ 10/28 00:34
4F：推 xenosdk:請問Tag是在哪個terminal? 10/28 01:17
5F：→ violescent:N端 10/28 12:11
6F：推 nzj:會不會tag包在裡面 要不要溶在6M urea作control 10/28 22:48
7F：推 nzj:另外應該作SDS-PAGE看有無overexpression，western很敏感 10/28 22:51
8F：推 nzj:上面一行請省略不看 10/28 22:56
9F：→ violescent:用6M GST 會掛掉吧？！ 這樣還是不bind @@" 10/28 23:12
※ 編輯: violescent 來自: 61.230.7.68 (10/28 23:17)
10F：推 nzj:那要不要試試his-tag? 10/28 23:29
11F：→ violescent:我試了His-SUMO system 結果好像也不太bind @@" 10/28 23:31
12F：→ violescent:所以我在想 是不是要把我的蛋白truncatd 短一點點試試 10/28 23:31
13F：推 nzj:也是加urea去溶 如果tag包在裡面的話應該抓得到 10/28 23:32
14F：→ nzj:如果induction在supernatant看得到 tag也沒被包住 10/28 23:34
15F：→ nzj:sequence也沒問題 沒有理由抓不到y 10/28 23:36
16F：推 nzj:his-tag column有重新包Ni2+? 10/28 23:56