作者violescent (看不清楚的眼睛..)
看板Biotech
标题[求救] 蛋白纯化
时间Mon Oct 27 21:38:33 2008
小弟之前用GST tag表现一个蛋白质
表现量还不错多 没有inclusion body 但是它就是binding的效率非常差
beads完全是新的 我用的buffer 是PBS
我个人也有试过其它的buffer 包含Tris 加了一些detergent
然後 在破菌前也加了DTT final 浓度 5mM
到後来加了Urea 因为害怕把GST弄挂 所以只有加了一点点 大概0.5M~1M都有用过
我也check 过capacity 用另一个GST的蛋白来做control 发现不是capacity的问题
蛋白质binding的效率仍然非常差 (我也check过GST有接在蛋白上 有做过western)
所以我放弃GST 改用另一个system
我用了his-SUMO fusion 的system
使用的buffer是50 mM Tris pH 7.4 , wash用 300 mM NaCl 30mM imidazole
elute 用 300mM NaCl, 300mM imidazole
虽然我只有试了一次 但是我发现 它好像也不太binding 光用wash buffer就洗下来了
elute没 什麽东东 flow through就一堆没有bind
所以结果 好像也是不太bind到beads上
所以 有人有遇过像这样不bind的问题吗？ 我应该放弃用tag来纯化吗？！
改用一般其它离子交换、gel filtration、hydrophobic.....
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※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 61.230.7.68
1F：推 borhen:首先你蛋白质有却定可以表现吗 induction有做吗 10/28 00:32
2F：→ borhen:有表现 理论上GST binding能力很强 别担心 10/28 00:33
3F：→ borhen:囧 打错了 你好像表现亮不错~@@ 10/28 00:34
4F：推 xenosdk:请问Tag是在哪个terminal? 10/28 01:17
5F：→ violescent:N端 10/28 12:11
6F：推 nzj:会不会tag包在里面 要不要溶在6M urea作control 10/28 22:48
7F：推 nzj:另外应该作SDS-PAGE看有无overexpression，western很敏感 10/28 22:51
8F：推 nzj:上面一行请省略不看 10/28 22:56
9F：→ violescent:用6M GST 会挂掉吧？！ 这样还是不bind @@" 10/28 23:12
※ 编辑: violescent 来自: 61.230.7.68 (10/28 23:17)
10F：推 nzj:那要不要试试his-tag? 10/28 23:29
11F：→ violescent:我试了His-SUMO system 结果好像也不太bind @@" 10/28 23:31
12F：→ violescent:所以我在想 是不是要把我的蛋白truncatd 短一点点试试 10/28 23:31
13F：推 nzj:也是加urea去溶 如果tag包在里面的话应该抓得到 10/28 23:32
14F：→ nzj:如果induction在supernatant看得到 tag也没被包住 10/28 23:34
15F：→ nzj:sequence也没问题 没有理由抓不到y 10/28 23:36
16F：推 nzj:his-tag column有重新包Ni2+? 10/28 23:56