作者cothuho (cothuho)
看板Biotech
標題[求救]如何偵測微量表現的膜蛋白
時間Sat Oct 25 22:25:30 2008
這個問題困擾已久
真的需要各位的幫助
小弟目前正在研究一種膜蛋白
他是一種tyrosine phosphatase
在肝臟的表現量很少
以文獻上來看
WB northern都沒有人偵測到過
只有RT-PCR有 我也重複過 的確有 但不強
現在我因為實驗目的的關係 一定要在WB偵測到
抽取whole cell protein後
最高load到500microgram
換過無數抗體都偵測不到
包括自行生產的抗體
現在想用抽取膜蛋白的方式
但是像這種只有RT偵測到的蛋白是不是要非常非常大體積的細胞萃取
才能夠得到足夠WB偵測的蛋白量？
從來沒有做過偵測這樣微量蛋白的實驗
實在不大清楚這實驗的盡頭在哪裡
強烈懷疑RT的結果是否代表真有protein product的存在
目前我已經有相當多biochem上的成果
但是in vivo上一直卡在證明其表現的上面
還請有經驗的各位幫忙了 感激不盡
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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 76.181.242.213
1F：推 vancent:密度梯度離心分離? 10/25 22:58
2F：推 jsi:組織切片免疫螢光染色有看過嗎? 這敏感度比WB高 此外 RT-PCR偵 10/25 23:00
3F：→ jsi:側的是RNA 不能代表蛋白質表現情形 如果您使用的liver可研磨成 10/25 23:02
4F：→ jsi:細胞 就可以染色上flow看看 10/25 23:03
5F：→ sweetE:flow cytometry呢? 抽膜蛋白過程中其實也會lose~ 10/25 23:06
6F：推 Nikio:ultra後，沈在底下的把他用sample buffer洗起來就濃縮嚕 10/26 01:15
7F：→ Nikio:反正肝臟很大咩 哈哈 還有cellbiochem好像有KIT可以抽 10/26 01:15
8F：推 Nikio:不過粉貴粉貴粉貴....... 10/26 02:59
9F：→ cothuho:不瞞各位 免疫染色有考慮過 加上我之前碩士就是靠形態拿的 10/26 09:41
10F：→ cothuho:但是現在的老闆是作生化的 對這種形態觀察很沒信心 屢次 10/26 09:42
11F：→ cothuho:建議不得採納 加上也不一定成功 不過現在死馬也得當活馬醫 10/26 09:43
12F：→ cothuho:ultra是什麼意思啊 是指sucrose的梯度離心嗎？ 10/26 09:45
13F：推 tsubasawolfy:ultra 超高速離心 10/26 10:16