作者cothuho (cothuho)
看板Biotech
标题[求救]如何侦测微量表现的膜蛋白
时间Sat Oct 25 22:25:30 2008
这个问题困扰已久
真的需要各位的帮助
小弟目前正在研究一种膜蛋白
他是一种tyrosine phosphatase
在肝脏的表现量很少
以文献上来看
WB northern都没有人侦测到过
只有RT-PCR有 我也重复过 的确有 但不强
现在我因为实验目的的关系 一定要在WB侦测到
抽取whole cell protein後
最高load到500microgram
换过无数抗体都侦测不到
包括自行生产的抗体
现在想用抽取膜蛋白的方式
但是像这种只有RT侦测到的蛋白是不是要非常非常大体积的细胞萃取
才能够得到足够WB侦测的蛋白量？
从来没有做过侦测这样微量蛋白的实验
实在不大清楚这实验的尽头在哪里
强烈怀疑RT的结果是否代表真有protein product的存在
目前我已经有相当多biochem上的成果
但是in vivo上一直卡在证明其表现的上面
还请有经验的各位帮忙了 感激不尽
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※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 76.181.242.213
1F：推 vancent:密度梯度离心分离? 10/25 22:58
2F：推 jsi:组织切片免疫萤光染色有看过吗? 这敏感度比WB高 此外 RT-PCR侦 10/25 23:00
3F：→ jsi:侧的是RNA 不能代表蛋白质表现情形 如果您使用的liver可研磨成 10/25 23:02
4F：→ jsi:细胞 就可以染色上flow看看 10/25 23:03
5F：→ sweetE:flow cytometry呢? 抽膜蛋白过程中其实也会lose~ 10/25 23:06
6F：推 Nikio:ultra後，沈在底下的把他用sample buffer洗起来就浓缩噜 10/26 01:15
7F：→ Nikio:反正肝脏很大咩 哈哈 还有cellbiochem好像有KIT可以抽 10/26 01:15
8F：推 Nikio:不过粉贵粉贵粉贵....... 10/26 02:59
9F：→ cothuho:不瞒各位 免疫染色有考虑过 加上我之前硕士就是靠形态拿的 10/26 09:41
10F：→ cothuho:但是现在的老板是作生化的 对这种形态观察很没信心 屡次 10/26 09:42
11F：→ cothuho:建议不得采纳 加上也不一定成功 不过现在死马也得当活马医 10/26 09:43
12F：→ cothuho:ultra是什麽意思啊 是指sucrose的梯度离心吗？ 10/26 09:45
13F：推 tsubasawolfy:ultra 超高速离心 10/26 10:16