作者pop6234 (表面的和平)
看板Biotech
標題[求救] ligation 的相關問題
時間Fri Oct 24 01:22:32 2008
常見ligation是16度C overnight
不知道有沒有人做過室溫的ligation
我自己有做過室溫15min的ligation
不過因為得到的clone數太多
老師覺得很不真實
覺得室溫ligation15min的方法非正統
得到的結果需要被質疑真實性
我們家用的是invitrogen的T4 DNA ligase
有人也有用過這樣的方法去做ligation嗎
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◆ From: 118.171.87.15
1F：推 yaliu:我比較常做4度c overnight...效果挺好的XD 10/24 01:25
2F：推 dankai:室溫15min我也覺得有點快~如果要快我們會放37度1hr~但大部 10/24 01:28
3F：→ dankai:份都像一樓~~放4度C overnight 10/24 01:29
4F：→ dankai:對了~你的室溫15min 每個clone都有接進去嗎!? 有點好奇~ 10/24 01:31
5F：推 h3250sam:我們做TA都是25度1hr 一般的clone這樣做也都有出來 10/24 03:05
6F：推 macrophage:NEB T4 ligase,室溫一小時,結果OK. 10/24 09:27
7F：推 shunze:有東西出來比較重要吧.現在那個技術不是講求節省時間 10/24 09:41
8F：推 enisx:之前趕時間的話,室溫下 3-4 hr 就transformation了,沒問題 10/24 12:33
9F：→ sGoat:酵素一到不都會有標準使用程序嗎?怕不準不是可以做對照組? 10/24 14:39
10F：→ sGoat:就一組接insert一組接D2水,或是藍白篩,抗生素篩,一翻兩瞪眼 10/24 14:40
11F：→ sGoat:把結果攤給你老板看不就知道有沒有可信度... 10/24 14:40
12F：推 leoblack:切完的vector alone也要一起ligation和塗plate做control 10/24 18:52
13F：→ pop6234:我有做過2次室溫15min的 第一次忘記挑幾顆(要翻記錄本) 10/25 18:59
14F：→ pop6234:但至少挑到了有8成有接進去 10/25 19:00
15F：→ pop6234:第二次挑10顆有9顆有接進去 10/25 19:01
16F：→ pop6234:雖然兩次我都有另外做一組 16度C overnight的 10/25 19:02
17F：→ pop6234:但是挑到我要的就沒有再從16度C的那組下去挑clone 10/25 19:02
18F：→ pop6234:我有送sequence 先證明這次的clone是正確的 10/25 19:04
19F：→ pop6234:這幾天會做實驗對照比較 10/25 19:06
20F：推 sGoat:應該不用到定序,就對照跟實驗組抽完plasmid用酵素切一刀 10/25 19:48
21F：→ sGoat:跑膠看長度就是一翻兩瞪眼了,除非你片段差異很小 10/25 19:49
22F：→ sGoat:而且要是plasmid沒接進去東西長度不會變,頂多接到不要的東西 10/25 19:51
23F：→ sGoat:接到不要的東西也是證明可以接東西進去,而不是接不進去 10/25 19:51
24F：→ sGoat:要是有空vector的話拿去切一刀也可以當對照組 10/25 19:53
25F：推 yaliu:說實在的PCR跟RE check或者定序都正確的話，那就是對的 10/25 22:46
26F：→ yaliu:ligation的條件那麼多種，有東西最重要！ 10/25 22:47