作者realm (realm)
看板Biotech
標題[求救] 關於phospho-protein的western blot
時間Fri Oct 17 04:16:11 2008
最近在研究JNK pathway...
以下有兩個問題:
1. 關於phospho-JNK的Western:
由於所用的1st antibody是phospho-JNK,
我想請問, phospho-JNK是否非常sensitive to freeze-thaw cycle?
因為我的實驗是time course, 以往我都是收完sample就直接往下做Western,
但而今time course所需的時間加長, 所以如要繼續往下做, 幾乎需要長時間的工作,
因為我們老師總強調這種phospho modification非常senstive,
所以我想試著在這裡請教可能有經驗的前輩, 相關的經驗...
我是否可以先freeze samples, 隔天再繼續往下做??
2. 我們的wash buffer是TBST (Tris base + NaCl + Tween 20)
根據Molecular Cloning的配法, pH要調至7.4
由於最近Western屢次不成功, 而且non-specific binding很多,
後來測試最近實驗室中新配的TBS stock, 發現配藥者沒有調pH, 因此約pH = 9
我猜想, 這會影響到實驗結果, 因為Ab binding和H bonds形成有關,
所以不對的pH值, 可能會造成不好的影響,
不知道我這樣想有沒有錯誤??
在此先謝謝各位大大的指教~~:)
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◆ From: 128.210.164.173
※ 編輯: realm 來自: 128.210.164.173 (10/17 04:17)
1F：推 EsMirada:2的影響比較大 10/17 07:54
2F：推 tsubasawolfy:2的影響很大 順便問誰配的朝他頭巴下去 10/17 08:15
3F：→ tsubasawolfy:1其實inhibitor加到超量就比較安心 10/17 08:16
4F：推 iiidns:phospho多加phospho inhibitor比較安心... 10/17 08:22
5F：→ iiidns:TBS沒調pH值 比較大的影響是 壓出來的結果 看起來有點 10/17 08:23
6F：→ iiidns:朦朧美 (自己害自己 沒話說....XD) 10/17 08:24
7F：→ realm:多謝樓上各位大大~~:) 10/17 12:39