作者realm (realm)
看板Biotech
标题[求救] 关於phospho-protein的western blot
时间Fri Oct 17 04:16:11 2008
最近在研究JNK pathway...
以下有两个问题:
1. 关於phospho-JNK的Western:
由於所用的1st antibody是phospho-JNK,
我想请问, phospho-JNK是否非常sensitive to freeze-thaw cycle?
因为我的实验是time course, 以往我都是收完sample就直接往下做Western,
但而今time course所需的时间加长, 所以如要继续往下做, 几乎需要长时间的工作,
因为我们老师总强调这种phospho modification非常senstive,
所以我想试着在这里请教可能有经验的前辈, 相关的经验...
我是否可以先freeze samples, 隔天再继续往下做??
2. 我们的wash buffer是TBST (Tris base + NaCl + Tween 20)
根据Molecular Cloning的配法, pH要调至7.4
由於最近Western屡次不成功, 而且non-specific binding很多,
後来测试最近实验室中新配的TBS stock, 发现配药者没有调pH, 因此约pH = 9
我猜想, 这会影响到实验结果, 因为Ab binding和H bonds形成有关,
所以不对的pH值, 可能会造成不好的影响,
不知道我这样想有没有错误??
在此先谢谢各位大大的指教~~:)
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※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 128.210.164.173
※ 编辑: realm 来自: 128.210.164.173 (10/17 04:17)
1F：推 EsMirada:2的影响比较大 10/17 07:54
2F：推 tsubasawolfy:2的影响很大 顺便问谁配的朝他头巴下去 10/17 08:15
3F：→ tsubasawolfy:1其实inhibitor加到超量就比较安心 10/17 08:16
4F：推 iiidns:phospho多加phospho inhibitor比较安心... 10/17 08:22
5F：→ iiidns:TBS没调pH值 比较大的影响是 压出来的结果 看起来有点 10/17 08:23
6F：→ iiidns:朦胧美 (自己害自己 没话说....XD) 10/17 08:24
7F：→ realm:多谢楼上各位大大~~:) 10/17 12:39