作者sweetE (sweetE)
看板Biotech
標題[求救] western problem
時間Sat Oct 11 14:45:12 2008
我想請問
在壓片的時候 第一次我壓了三分鐘
經過自動洗片機 在洗片的同時 我又壓了一個五分鐘的片子
第一片三分鐘的 洗出來 有東西
但是比我以前壓的signal弱(including GAPDH 這種BAND應該不弱的蛋白)
第二片 五分鐘的 洗出來 完全沒東西
我想~冷光應該不會DECAY的那麻快吧....
像出現這樣的現象 問題應該出在哪裡呢?
我唯一想到的問題 只有二抗
因為早上同一批membrane 我用上禮拜用過的一抗hy
二抗是新配的 (both in 5% skim milk)
不過我想我的一抗牛奶可能壞掉
但我還是試試看(因為抗體有限) 結果是壓不出來
然後 我就把membrane用TBST wash了一陣子之後
重新配一抗(這次用3%BSA配，比較不會壞掉) and重hy一次
不過二抗 我是用早上配的那個二抗(in milk)
結果就出現我最一開始說的那個狀況~
雖然說 早上也是hy了這個二抗 而HRP也一直在上面
應該是不會有"用光"的情形
因為加入了ECL 只要SUBSTRATE存在，那有HRP就可以work，就有冷光產生
所以 我也說不上來到底是不是因為二抗~
麻煩各位大大，替我看一下我的問題在哪裡~
謝謝你們!!!!
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◆ From: 61.217.147.117
1F：推 bb89233:我覺得是ECL有問題 10/11 21:16
2F：推 lail:可能是ECL用太久了,試著跟別實驗室借看看吧~ 10/11 21:20
3F：→ sweetE:但是這瓶ECL上禮拜還壓出來過......好奇怪啊!!! 10/12 14:21
4F：推 scorpiuswu:前兩個星期也遇過這樣的事 換新ECL就好了 10/14 16:32