作者leondemon (狗狗)
看板Biotech
標題[方法] Solexa/Illumina sequencing
時間Tue Oct 7 12:39:37 2008
Solexa於2006年被Illumina併購後
他的Ultra high-thoughput sequencing技術也被轉到Illumina下
但是對於Solexa技術 有許多不了解 我google找了很多資料 還是不能完全了解
希望有人能幫忙解答
1) Solexa對於每個核甘酸片段可以定序多少bp？ 它是定序兩頭還是單邊？
2) Solexa所使用的特殊核甘酸是什麼原理使得PCR過程可以在每nucleotide配對後停止
然後又可以在下一個cycle又繼續合成下去？
謝謝了
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◆ From: 140.129.77.13
2F：→ leondemon:謝謝你 這我有看過了 但是沒有得到解答耶 ^^" 10/07 23:02
3F：→ leondemon:目前我有找到資料寫可以兩端定序 大約36bp左右 10/07 23:03
4F：→ leondemon:但是每個如何移除那個fluorophore 則不知道 10/07 23:04
5F：→ leondemon:那個特殊核甘酸結構還是未知 只知道是有屬於私有財產 10/07 23:05
6F：推 kittypudding:它沒有在配對後停止啊,是一直做到完,只是很短 10/08 01:04
7F：→ kittypudding:通常人家專利的東西,不會把所有的都講清楚吧. 10/08 01:05
8F：推 sGoat:怎麼我的理解是可以做兩端定序,每秒大於36bp以上 10/08 08:23
9F：→ sGoat:每個cell可以提供每秒總數>3Gb的訊號... 10/08 08:24
10F：→ sGoat:他是配對一個核甘酸後停止,每次配對都會結合上一個核甘酸 10/08 08:26
11F：→ sGoat:至於方法不是對核甘酸進行modify就是對polymerse... 10/08 08:27
12F：→ sGoat:可能利用短時間heat shock的condition配合擴增 10/08 08:28
13F：→ sGoat:至於為何兩端可以定序只是因為某一片段有兩份copy以上的話 10/08 08:31
14F：→ sGoat:剛好使用到不同的adapter與cell上的adapter結合,判讀後得知 10/08 08:32
15F：→ sGoat:它好像沒有說到可以同時對cell上某一個well裡的片段 10/08 08:33
16F：→ sGoat:同時進行兩端序列的讀取... 10/08 08:33
17F：→ leondemon:sGoat會不會把Solexa講的太神了呀？ 10/08 13:49
18F：→ leondemon:另外回kitty 專利的東西在申請的時候必須要講清楚 10/08 13:52
19F：→ leondemon:我找到資料對於該核甘酸的技術 是用私有財產的字眼 10/08 13:52
20F：→ leondemon:所以很有可能沒有申請專利 只是沒人能知道那是什麼原理 10/08 13:53
21F：→ leondemon:Solexa最主要是能夠一次定序5千萬種不同的DNA分子 10/08 13:57
22F：→ leondemon:每個分子只要定序一端20個以上nt 就可以產生unique tag 10/08 13:58
23F：→ leondemon:再去比對基因體序列資料庫 就知道這片段來自哪裡 10/08 13:59
24F：→ leondemon:我目前看到介紹好像是可以一邊定序到36nt 可能不是極限 10/08 14:00
25F：→ leondemon:所以一次可以定1.5 Gbp 若是兩邊定序可達3 Gbp 10/08 14:01
26F：→ leondemon:他每bp定序是一個cycle 光要掃描5千萬colony就要很久 10/08 14:03
27F：→ leondemon:掃完後 不知道是用什麼chemistry 將block的fluorophore 10/08 14:04
28F：→ leondemon:自核甘酸尾巴移除 然後可以進行下一個cycle 10/08 14:04
29F：→ leondemon:但是木前就是找不到那個特殊修飾核甘酸的結構和原理是啥 10/08 14:05
31F：→ sGoat:另外,他每一次cycle是使用CCD camera take一張不用幾秒 10/08 16:03
32F：→ sGoat:就類似microarray的cell以點圖方式呈現,所以五千萬算小菜 10/08 16:05
33F：推 sGoat:更正,是第七頁... 10/08 16:07
34F：推 cryosakura:長度問題:現在有兩種kit，分別定18及36個base的長度 10/08 21:24
35F：→ cryosakura:要定兩頭則要用pair-end的kit 10/08 21:25
36F：→ cryosakura:要做pair-end時，要先把一端36base定完 10/08 21:28
37F：→ cryosakura:把序列倒接，再定另一頭 10/08 21:29
38F：推 cryosakura:還有，請不要叫cell，那叫做cluster 10/08 21:40
39F：推 cryosakura:真要叫的話也只有flow cell，上面有8個lane 10/08 22:25
40F：→ cryosakura:利用cluster station將cluster長在上面 10/08 22:26
41F：推 cryosakura:solexa是利用SBS(synthesis based sequence)的原理 10/08 22:30
42F：→ cryosakura:因此單一cluster一個cycle只加上一個base 10/08 22:31
43F：→ cryosakura:再拍四張照片分別detect ATGC上帶有的不同的訊號 10/08 22:33
44F：推 cryosakura:就可以得知這一個cluster在這個base是A or G or C or T 10/08 22:38
45F：→ cryosakura:就如我說的，他是一個flow cell，因此每一個cycle之間 10/08 22:40
46F：→ cryosakura:會pump藥劑將螢光訊號去除，並wash才進行另一次的cycle 10/08 22:42
47F：推 cryosakura:藥劑只寫了Cleavage Reagent，所以我也不知道他是什麼 10/08 22:48
48F：→ leondemon:還是很謝謝sGoat大的資訊 另外也謝謝cryo大的分享 10/09 00:08
49F：→ leondemon:我原本想說36個cycle還要用天數來算 以為是用scanning 10/09 00:12
50F：→ leondemon:CCD camera方式的確是聰明許多 10/09 00:12
51F：→ leondemon:果然還是需要討論才知道自己哪裡理解錯誤 謝謝大家啦～ 10/09 00:13
52F：→ leondemon:簡單來說 那個特殊核甘酸應該是把螢光劑接在3'端 10/09 00:35
53F：→ leondemon:可終止elongation 但是用特殊方法移除後 又可添加1 nt 10/09 00:35
54F：→ leondemon:這樣講應該對吧！？ 10/09 00:36
55F：推 sGoat:papper裡面有提到polymerase以及dye terminator nucleotide 10/09 09:14
56F：→ sGoat:所以應該是neuclotide會使polymerase只抓到它一個之後就做 10/09 09:15
57F：→ sGoat:不下去,然後polymerase應該是去除一個subunit使其結合不穩定 10/09 09:16
58F：→ sGoat:容易脫離template,而neuclotide也有可能是以抗體的方式 10/09 09:18
59F：→ sGoat:與dye做結合,因此才會有後續的strip可以將螢光去除,又不會 10/09 09:19
60F：→ sGoat:把neuclotide拔掉,以方便進行second round... 10/09 09:21
61F：→ sGoat:不過以上都是推測,因為我沒有信用卡可以看那兩篇文章XD 10/09 09:22