作者leondemon (狗狗)
看板Biotech
标题[方法] Solexa/Illumina sequencing
时间Tue Oct 7 12:39:37 2008
Solexa於2006年被Illumina并购後
他的Ultra high-thoughput sequencing技术也被转到Illumina下
但是对於Solexa技术 有许多不了解 我google找了很多资料 还是不能完全了解
希望有人能帮忙解答
1) Solexa对於每个核甘酸片段可以定序多少bp？ 它是定序两头还是单边？
2) Solexa所使用的特殊核甘酸是什麽原理使得PCR过程可以在每nucleotide配对後停止
然後又可以在下一个cycle又继续合成下去？
谢谢了
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※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 140.129.77.13
2F：→ leondemon:谢谢你 这我有看过了 但是没有得到解答耶 ^^" 10/07 23:02
3F：→ leondemon:目前我有找到资料写可以两端定序 大约36bp左右 10/07 23:03
4F：→ leondemon:但是每个如何移除那个fluorophore 则不知道 10/07 23:04
5F：→ leondemon:那个特殊核甘酸结构还是未知 只知道是有属於私有财产 10/07 23:05
6F：推 kittypudding:它没有在配对後停止啊,是一直做到完,只是很短 10/08 01:04
7F：→ kittypudding:通常人家专利的东西,不会把所有的都讲清楚吧. 10/08 01:05
8F：推 sGoat:怎麽我的理解是可以做两端定序,每秒大於36bp以上 10/08 08:23
9F：→ sGoat:每个cell可以提供每秒总数>3Gb的讯号... 10/08 08:24
10F：→ sGoat:他是配对一个核甘酸後停止,每次配对都会结合上一个核甘酸 10/08 08:26
11F：→ sGoat:至於方法不是对核甘酸进行modify就是对polymerse... 10/08 08:27
12F：→ sGoat:可能利用短时间heat shock的condition配合扩增 10/08 08:28
13F：→ sGoat:至於为何两端可以定序只是因为某一片段有两份copy以上的话 10/08 08:31
14F：→ sGoat:刚好使用到不同的adapter与cell上的adapter结合,判读後得知 10/08 08:32
15F：→ sGoat:它好像没有说到可以同时对cell上某一个well里的片段 10/08 08:33
16F：→ sGoat:同时进行两端序列的读取... 10/08 08:33
17F：→ leondemon:sGoat会不会把Solexa讲的太神了呀？ 10/08 13:49
18F：→ leondemon:另外回kitty 专利的东西在申请的时候必须要讲清楚 10/08 13:52
19F：→ leondemon:我找到资料对於该核甘酸的技术 是用私有财产的字眼 10/08 13:52
20F：→ leondemon:所以很有可能没有申请专利 只是没人能知道那是什麽原理 10/08 13:53
21F：→ leondemon:Solexa最主要是能够一次定序5千万种不同的DNA分子 10/08 13:57
22F：→ leondemon:每个分子只要定序一端20个以上nt 就可以产生unique tag 10/08 13:58
23F：→ leondemon:再去比对基因体序列资料库 就知道这片段来自哪里 10/08 13:59
24F：→ leondemon:我目前看到介绍好像是可以一边定序到36nt 可能不是极限 10/08 14:00
25F：→ leondemon:所以一次可以定1.5 Gbp 若是两边定序可达3 Gbp 10/08 14:01
26F：→ leondemon:他每bp定序是一个cycle 光要扫描5千万colony就要很久 10/08 14:03
27F：→ leondemon:扫完後 不知道是用什麽chemistry 将block的fluorophore 10/08 14:04
28F：→ leondemon:自核甘酸尾巴移除 然後可以进行下一个cycle 10/08 14:04
29F：→ leondemon:但是木前就是找不到那个特殊修饰核甘酸的结构和原理是啥 10/08 14:05
31F：→ sGoat:另外,他每一次cycle是使用CCD camera take一张不用几秒 10/08 16:03
32F：→ sGoat:就类似microarray的cell以点图方式呈现,所以五千万算小菜 10/08 16:05
33F：推 sGoat:更正,是第七页... 10/08 16:07
34F：推 cryosakura:长度问题:现在有两种kit，分别定18及36个base的长度 10/08 21:24
35F：→ cryosakura:要定两头则要用pair-end的kit 10/08 21:25
36F：→ cryosakura:要做pair-end时，要先把一端36base定完 10/08 21:28
37F：→ cryosakura:把序列倒接，再定另一头 10/08 21:29
38F：推 cryosakura:还有，请不要叫cell，那叫做cluster 10/08 21:40
39F：推 cryosakura:真要叫的话也只有flow cell，上面有8个lane 10/08 22:25
40F：→ cryosakura:利用cluster station将cluster长在上面 10/08 22:26
41F：推 cryosakura:solexa是利用SBS(synthesis based sequence)的原理 10/08 22:30
42F：→ cryosakura:因此单一cluster一个cycle只加上一个base 10/08 22:31
43F：→ cryosakura:再拍四张照片分别detect ATGC上带有的不同的讯号 10/08 22:33
44F：推 cryosakura:就可以得知这一个cluster在这个base是A or G or C or T 10/08 22:38
45F：→ cryosakura:就如我说的，他是一个flow cell，因此每一个cycle之间 10/08 22:40
46F：→ cryosakura:会pump药剂将萤光讯号去除，并wash才进行另一次的cycle 10/08 22:42
47F：推 cryosakura:药剂只写了Cleavage Reagent，所以我也不知道他是什麽 10/08 22:48
48F：→ leondemon:还是很谢谢sGoat大的资讯 另外也谢谢cryo大的分享 10/09 00:08
49F：→ leondemon:我原本想说36个cycle还要用天数来算 以为是用scanning 10/09 00:12
50F：→ leondemon:CCD camera方式的确是聪明许多 10/09 00:12
51F：→ leondemon:果然还是需要讨论才知道自己哪里理解错误 谢谢大家啦～ 10/09 00:13
52F：→ leondemon:简单来说 那个特殊核甘酸应该是把萤光剂接在3'端 10/09 00:35
53F：→ leondemon:可终止elongation 但是用特殊方法移除後 又可添加1 nt 10/09 00:35
54F：→ leondemon:这样讲应该对吧！？ 10/09 00:36
55F：推 sGoat:papper里面有提到polymerase以及dye terminator nucleotide 10/09 09:14
56F：→ sGoat:所以应该是neuclotide会使polymerase只抓到它一个之後就做 10/09 09:15
57F：→ sGoat:不下去,然後polymerase应该是去除一个subunit使其结合不稳定 10/09 09:16
58F：→ sGoat:容易脱离template,而neuclotide也有可能是以抗体的方式 10/09 09:18
59F：→ sGoat:与dye做结合,因此才会有後续的strip可以将萤光去除,又不会 10/09 09:19
60F：→ sGoat:把neuclotide拔掉,以方便进行second round... 10/09 09:21
61F：→ sGoat:不过以上都是推测,因为我没有信用卡可以看那两篇文章XD 10/09 09:22