作者tinapig (提那豬)
看板Biotech
標題Re: <求救>lipofectamine 效率
時間Tue Oct 7 11:44:27 2008
※ 引述《nidus (咕嘰)》之銘言：
: ※ [本文轉錄自 Biology 看板]
: 作者: nidus (咕嘰) 看板: Biology
: 標題: <求救>lipofectamine 效率
: 時間: Sun Oct 5 22:49:17 2008
: 請問有人用過嗎？？
: 我做了好幾次效率低到看不到想要表現的protein
: 我的步驟如下：
: genaid抽plasmid 再以酒精沈澱進一步純化
我之前是不需要用到酒精鹽沈澱,抽完的產物基本上就ok
: 使用細胞為hela
(我是用RD細胞)
: transfect 前一天在六公分盤種9X10五次方細胞
: 第二天取500λserum free DMEM 與 3μg plasmid混和
: 20λlipofectamine與500λserum free DMEM混和 等五分鐘
: 將上述兩溶液混和 等20分鐘
: 將混合液倒入昨天seeding好的HeLa cell 六公分盤中
: HeLa cell 六公分盤會先以PBS wash兩次 以將serum洗掉
: 六小時候再將medium置換成有serum的DMEM
: 24小時候收細胞 western檢測
: -------------------------------------------------------------------
: plasmid有提高至8μg 結果還是一樣
: plasmid也有digest後跑膠 位置也對
請問有確認過sequence嗎？
確認您的start codon跟fusion protein跟您的tag有in frame?
: 只不過我欲表現的protein 並不是一個完整的protein
: 完整序列有276aa 而我只有取1~120
: 請問有沒有可能是無法folding而被進一步degrate掉？？
我覺得有可能,因為我遇過類似的狀況
某protein的一系列deletional mutation
就有一兩個是幾乎不表現(band很弱)
當時有學長建議我用MG132之類的protein degradation inhibitor
後來真的有增加產量
(但也沒有正常表現的多)
若您實驗室有現成的protease inhibitor
-->抱歉我是指"proteasome inhibitor"
也許可以試試看
或者如果是怕transfection 效率不好
也許下次可以做一個postive control~
同時多做一組已確定可表現的construct
這樣也可以幫忙釐清是否transfection效率問題
不確定是否能幫到您～
以上
: 以上希望有大大相助 任何建議都好
: 謝謝
--
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◆ From: 140.128.140.89
※ 編輯: tinapig 來自: 140.128.140.89 (10/07 11:50)
1F：推 nidus:其實我每次做都會加protease inhibitor(cocktial).... 10/08 17:13
抱歉我是指proteasome inhibitor 一類的藥(原文訂正處)
2F：→ nidus:我也有一組positive Control 也都有大量表現出來.... 10/08 17:15
3F：→ nidus:因為目前我使用的這幾組deletional protein以前的學姐有表現 10/08 17:16
4F：→ nidus:出來,所以我猜應該也都有in frame 10/08 17:17
5F：→ nidus:找不到原因下...目前我是換一個cell line(HEK 293)來做做看 10/08 17:20
6F：→ nidus:如果在做不出來...應該會sequencing那些plasmid吧>"< 10/08 17:20
恩嗯,也許sequencing會是最快最直接的方法
(可以先思考是否有可能菌的保存有沒有可能污染？拿錯？)
7F：→ nidus:謝謝您熱心的建議^^ 10/08 17:21
不客氣～希望您實驗順利囉^^
※ 編輯: tinapig 來自: 140.128.140.89 (10/08 17:23)