作者tinapig (提那猪)
看板Biotech
标题Re: <求救>lipofectamine 效率
时间Tue Oct 7 11:44:27 2008
※ 引述《nidus (咕叽)》之铭言：
: ※ [本文转录自 Biology 看板]
: 作者: nidus (咕叽) 看板: Biology
: 标题: <求救>lipofectamine 效率
: 时间: Sun Oct 5 22:49:17 2008
: 请问有人用过吗？？
: 我做了好几次效率低到看不到想要表现的protein
: 我的步骤如下：
: genaid抽plasmid 再以酒精沈淀进一步纯化
我之前是不需要用到酒精盐沈淀,抽完的产物基本上就ok
: 使用细胞为hela
(我是用RD细胞)
: transfect 前一天在六公分盘种9X10五次方细胞
: 第二天取500λserum free DMEM 与 3μg plasmid混和
: 20λlipofectamine与500λserum free DMEM混和 等五分钟
: 将上述两溶液混和 等20分钟
: 将混合液倒入昨天seeding好的HeLa cell 六公分盘中
: HeLa cell 六公分盘会先以PBS wash两次 以将serum洗掉
: 六小时候再将medium置换成有serum的DMEM
: 24小时候收细胞 western检测
: -------------------------------------------------------------------
: plasmid有提高至8μg 结果还是一样
: plasmid也有digest後跑胶 位置也对
请问有确认过sequence吗？
确认您的start codon跟fusion protein跟您的tag有in frame?
: 只不过我欲表现的protein 并不是一个完整的protein
: 完整序列有276aa 而我只有取1~120
: 请问有没有可能是无法folding而被进一步degrate掉？？
我觉得有可能,因为我遇过类似的状况
某protein的一系列deletional mutation
就有一两个是几乎不表现(band很弱)
当时有学长建议我用MG132之类的protein degradation inhibitor
後来真的有增加产量
(但也没有正常表现的多)
若您实验室有现成的protease inhibitor
-->抱歉我是指"proteasome inhibitor"
也许可以试试看
或者如果是怕transfection 效率不好
也许下次可以做一个postive control~
同时多做一组已确定可表现的construct
这样也可以帮忙厘清是否transfection效率问题
不确定是否能帮到您～
以上
: 以上希望有大大相助 任何建议都好
: 谢谢
--
※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 140.128.140.89
※ 编辑: tinapig 来自: 140.128.140.89 (10/07 11:50)
1F：推 nidus:其实我每次做都会加protease inhibitor(cocktial).... 10/08 17:13
抱歉我是指proteasome inhibitor 一类的药(原文订正处)
2F：→ nidus:我也有一组positive Control 也都有大量表现出来.... 10/08 17:15
3F：→ nidus:因为目前我使用的这几组deletional protein以前的学姐有表现 10/08 17:16
4F：→ nidus:出来,所以我猜应该也都有in frame 10/08 17:17
5F：→ nidus:找不到原因下...目前我是换一个cell line(HEK 293)来做做看 10/08 17:20
6F：→ nidus:如果在做不出来...应该会sequencing那些plasmid吧>"< 10/08 17:20
恩嗯,也许sequencing会是最快最直接的方法
(可以先思考是否有可能菌的保存有没有可能污染？拿错？)
7F：→ nidus:谢谢您热心的建议^^ 10/08 17:21
不客气～希望您实验顺利罗^^
※ 编辑: tinapig 来自: 140.128.140.89 (10/08 17:23)