有個我想研究的蛋白 目前只知道某個transcription factor會bind到enhancer上 增加此蛋白的轉錄情形 在mRNA 或蛋白上 都能看到增加 其他有關這個蛋白的調控方式都沒有相關報導 而我給細胞的處理是給nuclear receptor的agonist 在第三天後從Western blot發現此蛋白的量減少 RT-PCR上可看到mRNA減少了 現在想找尋分子機轉 從review 得知 nuclear receptor 進行Transrepression的機轉有幾種 1. direct interaction 直接和transcription complex結合 讓它不能bind DNA 2. induction of negative regulator 轉錄negative regulator 讓Transcription factor無法有能力 3. inhibion of kinase activity 抑制kinase活性 需要磷酸化的transcription factor 就失去活性了 4. competition of coactivator 跟 1 有點像 跟coactivator 結合 不讓它和其他transcription factor結合 5. inhibion of co-repressor clearance 會抑制repressor離開DNA 進而降低這蛋白的基因表現 6. chromatin comformation change 讓chromatin 更compact 使transcription factor不能靠近 7. inhibition of hyperphosphorylation of RNA polymerase II 這樣就轉錄不能elongation 另外 有一可能是我自己想的 搞不好trancription factor bind 到 DNA上抑制轉錄 可是到了3天後才有效果 有可能嗎 這可以用DNA footprinting 來檢驗嗎 關於1-7種可能 在資料有限的情形下 要用甚麼方法來找到屬於哪種情形呢 以下是我設想的方法 1 抽核蛋白 用CO-IP 先用抗體抓下最前面所提到的transcription factor 再做western blot 看看我活化的nuclear receptor有沒有在裡面 2-6 造成的結果都是讓 trancriptio factor complex bind在DNA上的能力減弱 合成 32P probe 去 hybridize 我研究蛋白的基因consensus sequence上 加入核蛋白 用spin column離下來 然後再做hybridization 看看信號有變弱嗎 可是可以直接跟control比嗎 還是要有個internal control先normalize? 7 ??? 不知道怎麼檢驗 謝謝大家看完我的文章 若有甚麼想法可以回覆 如果可以分辨出是哪一種抑制方式最好了 讓我參考一下該如何進行下一步實驗 --

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