有个我想研究的蛋白 目前只知道某个transcription factor会bind到enhancer上 增加此蛋白的转录情形 在mRNA 或蛋白上 都能看到增加 其他有关这个蛋白的调控方式都没有相关报导 而我给细胞的处理是给nuclear receptor的agonist 在第三天後从Western blot发现此蛋白的量减少 RT-PCR上可看到mRNA减少了 现在想找寻分子机转 从review 得知 nuclear receptor 进行Transrepression的机转有几种 1. direct interaction 直接和transcription complex结合 让它不能bind DNA 2. induction of negative regulator 转录negative regulator 让Transcription factor无法有能力 3. inhibion of kinase activity 抑制kinase活性 需要磷酸化的transcription factor 就失去活性了 4. competition of coactivator 跟 1 有点像 跟coactivator 结合 不让它和其他transcription factor结合 5. inhibion of co-repressor clearance 会抑制repressor离开DNA 进而降低这蛋白的基因表现 6. chromatin comformation change 让chromatin 更compact 使transcription factor不能靠近 7. inhibition of hyperphosphorylation of RNA polymerase II 这样就转录不能elongation 另外 有一可能是我自己想的 搞不好trancription factor bind 到 DNA上抑制转录 可是到了3天後才有效果 有可能吗 这可以用DNA footprinting 来检验吗 关於1-7种可能 在资料有限的情形下 要用甚麽方法来找到属於哪种情形呢 以下是我设想的方法 1 抽核蛋白 用CO-IP 先用抗体抓下最前面所提到的transcription factor 再做western blot 看看我活化的nuclear receptor有没有在里面 2-6 造成的结果都是让 trancriptio factor complex bind在DNA上的能力减弱 合成 32P probe 去 hybridize 我研究蛋白的基因consensus sequence上 加入核蛋白 用spin column离下来 然後再做hybridization 看看信号有变弱吗 可是可以直接跟control比吗 还是要有个internal control先normalize? 7 ??? 不知道怎麽检验 谢谢大家看完我的文章 若有甚麽想法可以回覆 如果可以分辨出是哪一种抑制方式最好了 让我参考一下该如何进行下一步实验 --

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