作者tsubasawolfy (悠久の翼)
看板Biotech
標題Re: [求救] competent cell製作
時間Tue Sep 30 19:59:43 2008
※ 引述《bolly (bolly)》之銘言：
: 我們實驗室之前都是直接買kit作transform
: 但是我覺得有點浪費 所以想試著自己作作看
: 我用一瓶看起來有點年代的氯化鈣配製成0.1M溶液(已滅菌)
: 將0.5ml over-night菌液加入50ml LB養到OD 0.4
: 3200g離心去除上清液 加入20ml氯化鈣使懸浮
: 置冰上40min 離心10min 去除上清液
: 最後加1ml氯化鈣重新懸浮 分裝0.2ml一管
: 製作的菌種是DH5aphla 和BL21(DE3)
: 直接作transform 但是都長不出來
: 我想請問製作過程還需要注意什麼小細節
: 因為我是自己摸索 已經作過好幾次都不成功
: 之前有請別間實驗室的學姐教過 有作出來
: 但是使用的藥品是他們實驗室配的
: 回來自己作的幾次都失敗 很灰心= =
前置
1. CaCl2
60mM CaCl2----2.088g
15% Glycerol-30mL
10mM PIPES----0.6048g
-----------------------
add ddw to 200mL
2.加熱溶解後冷卻
3.滴定pH到 7.0
4.滅菌後冷卻放到4C保存
製作==要訣就保持低溫 跟輕輕沖洗
1.50mL LB+10uL origenal E.coli
2.Incubate at 37C for 16hr (DH5A)
3.Transfer 4mL Step2 to 400 LB medium
5.測定到OD590-0.375 到達後分裝到50cc tube, incubate on ice for 10min.
6.離心10min 3000rpm.4C
7.移除LB 加入CaCl2 10mL 懸浮(on ice)<--清清沖洗
8.離心5min. 2500rpm. 4C
9.移除CaCl2.加入CaCl2 10mL, incubate on ice for 10min
10.離心5min. 2500rpm. 4C
11.移除CaCl2,加入2mL重新懸浮後放置冰中overnight(冰桶丟4C冰箱)
12.離心5min. 2500rpm. 4C
13.移除CaCl2,加入新的2mL後分裝到eppendorf 保存-80C
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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 163.15.174.206
1F：推 alaric:加了CaCl2後, 離心g值小一點, 2400xg 09/30 20:28
2F：推 shunze:我都冰著一罐菌液 要用時取一些出來活化O/N 09/30 21:36
3F：→ shunze:每次冰的時間都半小時 然後丟N2 接著擺進-80度C 09/30 21:37