作者tsubasawolfy (悠久の翼)
看板Biotech
标题Re: [求救] competent cell制作
时间Tue Sep 30 19:59:43 2008
※ 引述《bolly (bolly)》之铭言：
: 我们实验室之前都是直接买kit作transform
: 但是我觉得有点浪费 所以想试着自己作作看
: 我用一瓶看起来有点年代的氯化钙配制成0.1M溶液(已灭菌)
: 将0.5ml over-night菌液加入50ml LB养到OD 0.4
: 3200g离心去除上清液 加入20ml氯化钙使悬浮
: 置冰上40min 离心10min 去除上清液
: 最後加1ml氯化钙重新悬浮 分装0.2ml一管
: 制作的菌种是DH5aphla 和BL21(DE3)
: 直接作transform 但是都长不出来
: 我想请问制作过程还需要注意什麽小细节
: 因为我是自己摸索 已经作过好几次都不成功
: 之前有请别间实验室的学姐教过 有作出来
: 但是使用的药品是他们实验室配的
: 回来自己作的几次都失败 很灰心= =
前置
1. CaCl2
60mM CaCl2----2.088g
15% Glycerol-30mL
10mM PIPES----0.6048g
-----------------------
add ddw to 200mL
2.加热溶解後冷却
3.滴定pH到 7.0
4.灭菌後冷却放到4C保存
制作==要诀就保持低温 跟轻轻冲洗
1.50mL LB+10uL origenal E.coli
2.Incubate at 37C for 16hr (DH5A)
3.Transfer 4mL Step2 to 400 LB medium
5.测定到OD590-0.375 到达後分装到50cc tube, incubate on ice for 10min.
6.离心10min 3000rpm.4C
7.移除LB 加入CaCl2 10mL 悬浮(on ice)<--清清冲洗
8.离心5min. 2500rpm. 4C
9.移除CaCl2.加入CaCl2 10mL, incubate on ice for 10min
10.离心5min. 2500rpm. 4C
11.移除CaCl2,加入2mL重新悬浮後放置冰中overnight(冰桶丢4C冰箱)
12.离心5min. 2500rpm. 4C
13.移除CaCl2,加入新的2mL後分装到eppendorf 保存-80C
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※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 163.15.174.206
1F：推 alaric:加了CaCl2後, 离心g值小一点, 2400xg 09/30 20:28
2F：推 shunze:我都冰着一罐菌液 要用时取一些出来活化O/N 09/30 21:36
3F：→ shunze:每次冰的时间都半小时 然後丢N2 接着摆进-80度C 09/30 21:37