作者suming77 (Sophia)
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標題Re: [求救] 有沒有水稻actin PCR必殺條件
時間Fri Sep 26 07:20:28 2008
※ 引述《lainhat (下一個天亮...)》之銘言：
: 但意外的卻在第一次沒有P出actin的某個line有P出來=.=?
: 之後也陸陸續續在不同的line都有P出actin 但都沒有全部sample都有
: 為了要達到每個lines都能順利P出actin當quantitative control
: 所以已經快起笑了
rice actin 我有做過 RT-PCR，沒什麼問題
你有PCR成功過 就排除primer設計問題
所以RT-PCR穩定不外乎
1. RNA與cDNA 品質 1st-cDNA仍易degrade 所以保存樣品RNA -80, cDNA -20 C
2. 全程冰上操作
3. PCR template量夠不夠 PCR 總體積20 ul 1st-cDNA大約用0.2~0.5 microgram
: 想請問各位大大有沒有必殺條件
: actin要夾出的size為504bp
: ---------------------------------
: 最近跑的條件是 PCR條件照所買Taq 建議
: 93度C,1'
: [93度C,30"
: 55度C,30"
: 72度C,20"]*25 如果你的Taq 1K/min 20sec太短了 504 bp 用35 sec比較保險
actin 25 cycle 應該能PCR出來
作為positive control時不妨提高到32~35
作為quantity control follow實驗組cycle 數 20 25 應都OK
: 72度C,10'
: 4度C,---
: ----------------------------------
: 量
: cDNA 各2 (總體積100 ul，cDNA template 應1~2.5 micogram)
: 5'(25uM) 1
: 3'(25uM) 1
: dNTP(10mM) 1
: Taq 0.3
: buffer 10
: ddH2O 補至100出頭(多個幾ul)
: -------------------------------------
: 100(分成5管,每管20ul)
--
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◆ From: 218.170.49.151
1F：推 Talen:就如同回文所提及的都很重要..Ex: RNA cDNA PCR mixture等 09/26 16:50
2F：→ Talen:感覺PCR結果每次都不是太穩定...建議你能control盡量control 09/26 16:52
3F：→ Talen:建議你先拿個可以PCR出來的template先PCR看看 09/26 16:53
4F：→ Talen:確認PCR mixture沒有問題 當然最好是拿學長姐的cDNA去PCR 09/26 16:55
5F：推 Talen:RNA品質好不好也要check 例如我們Lab是以5 ug RNA轉cDNA 09/26 16:57
6F：→ Talen:最後cDNA為20 ul 再取1 ul作為PCR反應的template... 09/26 16:58
7F：→ Talen:RNA定量品質要沒問題！ 轉cDNA步驟雖是小細節卻很重要！ 09/26 17:01
8F：推 Talen:最好就是找個高手 看你從頭做到尾....步驟一一的檢討...加油 09/26 17:03
9F：推 lainhat:感謝各位大大^^ 我會加油的! 09/27 00:35