作者suming77 (Sophia)
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标题Re: [求救] 有没有水稻actin PCR必杀条件
时间Fri Sep 26 07:20:28 2008
※ 引述《lainhat (下一个天亮...)》之铭言：
: 但意外的却在第一次没有P出actin的某个line有P出来=.=?
: 之後也陆陆续续在不同的line都有P出actin 但都没有全部sample都有
: 为了要达到每个lines都能顺利P出actin当quantitative control
: 所以已经快起笑了
rice actin 我有做过 RT-PCR，没什麽问题
你有PCR成功过 就排除primer设计问题
所以RT-PCR稳定不外乎
1. RNA与cDNA 品质 1st-cDNA仍易degrade 所以保存样品RNA -80, cDNA -20 C
2. 全程冰上操作
3. PCR template量够不够 PCR 总体积20 ul 1st-cDNA大约用0.2~0.5 microgram
: 想请问各位大大有没有必杀条件
: actin要夹出的size为504bp
: ---------------------------------
: 最近跑的条件是 PCR条件照所买Taq 建议
: 93度C,1'
: [93度C,30"
: 55度C,30"
: 72度C,20"]*25 如果你的Taq 1K/min 20sec太短了 504 bp 用35 sec比较保险
actin 25 cycle 应该能PCR出来
作为positive control时不妨提高到32~35
作为quantity control follow实验组cycle 数 20 25 应都OK
: 72度C,10'
: 4度C,---
: ----------------------------------
: 量
: cDNA 各2 (总体积100 ul，cDNA template 应1~2.5 micogram)
: 5'(25uM) 1
: 3'(25uM) 1
: dNTP(10mM) 1
: Taq 0.3
: buffer 10
: ddH2O 补至100出头(多个几ul)
: -------------------------------------
: 100(分成5管,每管20ul)
--
※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 218.170.49.151
1F：推 Talen:就如同回文所提及的都很重要..Ex: RNA cDNA PCR mixture等 09/26 16:50
2F：→ Talen:感觉PCR结果每次都不是太稳定...建议你能control尽量control 09/26 16:52
3F：→ Talen:建议你先拿个可以PCR出来的template先PCR看看 09/26 16:53
4F：→ Talen:确认PCR mixture没有问题 当然最好是拿学长姐的cDNA去PCR 09/26 16:55
5F：推 Talen:RNA品质好不好也要check 例如我们Lab是以5 ug RNA转cDNA 09/26 16:57
6F：→ Talen:最後cDNA为20 ul 再取1 ul作为PCR反应的template... 09/26 16:58
7F：→ Talen:RNA定量品质要没问题！ 转cDNA步骤虽是小细节却很重要！ 09/26 17:01
8F：推 Talen:最好就是找个高手 看你从头做到尾....步骤一一的检讨...加油 09/26 17:03
9F：推 lainhat:感谢各位大大^^ 我会加油的! 09/27 00:35