作者EscaflowneXP (Justin)
看板Biotech
標題[求救] PCR p不出來
時間Thu Sep 25 00:36:53 2008
小弟 最近在P一個基因的promoter (GC%=42% 長度=1kb)
所以先從genomic DNA開始做起
然後就是設計primer
我有設計和paper一樣的如下
5' Tm GC%
CCG A/CCGGT GAGCTC AAA TCA GTC AAA CCT AAG AA 65.5 49
------- --------------------------
enzyme cut complement to genomic DNA
3'
GA A/GATCT CTC GAG GGCC ATG GCG CCG GCT CGT GCT T 73.3 65
------- --------------------------
enzyme cut complement to genomic DNA
讓我覺得很奇怪的是 paper為何會在5'端設計多出 GAG CTC 這段序列???
而且還讓 5'和3'primer這端互補(3' CTC GAG)
把它拿去P之後
94(5min) {94(30s)-annealing tm(30s)-72(1min)}30個cycle --72(10min)--4oC
嘗試過annealing 的溫度
56.3 57.4 59.0 60.7 63.2 65 66.6 67.8 68.9 69.3
結果是都沒有P出來 而且在3kb有很強的band(冏)
所以我是不是應該把GAGCTC這段序列拿掉???
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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 122.124.101.163
1F：推 alaric:GAGCT/C --> SacI切位. 09/25 00:46
2F：→ EscaflowneXP:可是我不用 用到這個cutting site阿 09/25 01:05
3F：推 sisyphus:那就不要放啊XD 你也太可愛了 09/25 01:15
4F：→ EscaflowneXP:學姊 叫我放的........ 09/25 01:18
5F：推 borhen:我笑了～～ 09/25 03:16
6F：推 davideason:孩子~是你要對自己的實驗負責~學姊學長甚至是老闆的 09/25 13:33
7F：→ davideason:交代~ 你也要自己邏輯思考之後再去動作~不然要是出包 09/25 13:34
8F：→ davideason:那些人沒人會跳出來幫你扛的 09/25 13:34
9F：→ davideason:甚至可能還會在開會時聯合指責你~ 09/25 13:35
10F：推 pwl:大推樓上... 09/25 16:58
11F：推 rivis:primer的方向性是不是寫錯了？ 09/25 17:42
12F：推 rivis:看不出來會形成dimer，產物拿去定序看看吧 09/25 17:46
13F：推 jsi:同意davideason的說法 不過另外建議原PO 可以把你的想法跟問題 09/25 23:37
14F：→ jsi:先和老師學長姐討論 他們應該會比版上的朋友更了解你的實驗 09/25 23:38
15F：推 jsi:討論的結果或許會更加完善 09/25 23:42
16F：→ jsi:btw, paper上的序列有時候可能會錯(我就遇過XD) 若database查 09/25 23:44
17F：→ jsi:得到原始序列可以自己先確認看看是否正確 09/25 23:45
18F：推 ftsyice:樓上說的沒錯,paper的序列可能"惡意筆誤",到BLAST確認一下 09/26 00:14
19F：推 higamanami:惡意筆誤.....這是指什麼意思 可以說明一下嗎 09/26 01:55
20F：推 dankai:惡意筆誤 就是該paper作者有所保留~不想讓別人知道!所以小 09/26 08:09
21F：→ dankai:小修改一下~~~ 有的真的會這樣!BLAST一下比較保險~ 09/26 08:10
22F：推 qtzbbztq:囧惡意筆誤的還能登出來Orz.. 09/28 01:56
23F：推 ftsyice:可以 不影響實驗結果 09/29 00:10
24F：→ jbking:現在的小朋友越來越可愛了 09/29 10:50