作者EscaflowneXP (Justin)
看板Biotech
标题[求救] PCR p不出来
时间Thu Sep 25 00:36:53 2008
小弟 最近在P一个基因的promoter (GC%=42% 长度=1kb)
所以先从genomic DNA开始做起
然後就是设计primer
我有设计和paper一样的如下
5' Tm GC%
CCG A/CCGGT GAGCTC AAA TCA GTC AAA CCT AAG AA 65.5 49
------- --------------------------
enzyme cut complement to genomic DNA
3'
GA A/GATCT CTC GAG GGCC ATG GCG CCG GCT CGT GCT T 73.3 65
------- --------------------------
enzyme cut complement to genomic DNA
让我觉得很奇怪的是 paper为何会在5'端设计多出 GAG CTC 这段序列???
而且还让 5'和3'primer这端互补(3' CTC GAG)
把它拿去P之後
94(5min) {94(30s)-annealing tm(30s)-72(1min)}30个cycle --72(10min)--4oC
尝试过annealing 的温度
56.3 57.4 59.0 60.7 63.2 65 66.6 67.8 68.9 69.3
结果是都没有P出来 而且在3kb有很强的band(冏)
所以我是不是应该把GAGCTC这段序列拿掉???
--
※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 122.124.101.163
1F：推 alaric:GAGCT/C --> SacI切位. 09/25 00:46
2F：→ EscaflowneXP:可是我不用 用到这个cutting site阿 09/25 01:05
3F：推 sisyphus:那就不要放啊XD 你也太可爱了 09/25 01:15
4F：→ EscaflowneXP:学姊 叫我放的........ 09/25 01:18
5F：推 borhen:我笑了～～ 09/25 03:16
6F：推 davideason:孩子~是你要对自己的实验负责~学姊学长甚至是老板的 09/25 13:33
7F：→ davideason:交代~ 你也要自己逻辑思考之後再去动作~不然要是出包 09/25 13:34
8F：→ davideason:那些人没人会跳出来帮你扛的 09/25 13:34
9F：→ davideason:甚至可能还会在开会时联合指责你~ 09/25 13:35
10F：推 pwl:大推楼上... 09/25 16:58
11F：推 rivis:primer的方向性是不是写错了？ 09/25 17:42
12F：推 rivis:看不出来会形成dimer，产物拿去定序看看吧 09/25 17:46
13F：推 jsi:同意davideason的说法 不过另外建议原PO 可以把你的想法跟问题 09/25 23:37
14F：→ jsi:先和老师学长姐讨论 他们应该会比版上的朋友更了解你的实验 09/25 23:38
15F：推 jsi:讨论的结果或许会更加完善 09/25 23:42
16F：→ jsi:btw, paper上的序列有时候可能会错(我就遇过XD) 若database查 09/25 23:44
17F：→ jsi:得到原始序列可以自己先确认看看是否正确 09/25 23:45
18F：推 ftsyice:楼上说的没错,paper的序列可能"恶意笔误",到BLAST确认一下 09/26 00:14
19F：推 higamanami:恶意笔误.....这是指什麽意思 可以说明一下吗 09/26 01:55
20F：推 dankai:恶意笔误 就是该paper作者有所保留~不想让别人知道!所以小 09/26 08:09
21F：→ dankai:小修改一下~~~ 有的真的会这样!BLAST一下比较保险~ 09/26 08:10
22F：推 qtzbbztq:囧恶意笔误的还能登出来Orz.. 09/28 01:56
23F：推 ftsyice:可以 不影响实验结果 09/29 00:10
24F：→ jbking:现在的小朋友越来越可爱了 09/29 10:50