作者borhen (希望夢想成真)
看板Biotech
標題Re: [求救] 有關於SDS-PAGE transfer 的問題
時間Tue Sep 23 21:02:16 2008
※ 引述《borhen (希望夢想成真)》之銘言：
: 有一個問題想向大家請教一下
: 我們實驗室是利用半乾式轉置槽做protein 轉置到membrane
: 發現到一個很怪的現像
: 蛋白質sample為細胞total protein 所以理論上大到小都有
: 1. 我們把轉置完的sds-page 拿去染色
: 發現到大分子量的蛋白質 大部分留在membrane上
: 但小分子量的protein都是乾乾淨淨的
: 甚至放在最下層的3M paper 有發現protein marker的存在
: 請問各位專家 實驗到底發生什麼樣的事情~@@
: 請大家給點建議~~謝謝
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◆ From: 140.113.173.43
1F：推 aceliang:轉漬？09/23 20:07
2F：推 aborwang:protein大小的差異，如果目標蛋白分子量大一點(>100kD)09/23 20:12
3F：→ aborwang:我會延長transfer時間10%~20%09/23 20:13
4F：推 tsubasawolfy:transfer太久小分子亮的protein會跑過membrane..09/23 20:42
5F：→ tsubasawolfy:不過還是要看你membrane材質(孔徑) 09/23 20:42
6F：→ tsubasawolfy: 量- - 09/23 20:42
目前最為常用的NC paper 跟 PVDF都有試過~@@
都有這樣的現象產生 可是我一直再想~~ protein 太大會殘留再SDS-PAGE上
protein 太小transfer太久又會過頭
請問你們實驗~@@ 有這樣的現象嗎~~~~ 埃~~~~
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◆ From: 140.113.173.43
7F：推 aborwang:當然也會遇到，所以要針對自己的目標蛋白抓condition 09/23 21:08
8F：→ aborwang:以我的p53為例，使用Millipore的0.45um PVDF 09/23 21:10
9F：→ aborwang:我用每平方公分2mA 半乾式transfer 1hr，若大分子就久點 09/23 21:12
10F：→ aborwang:你不妨先參考membrane說明書的建議時間及安培數，再根據 09/23 21:14
11F：→ aborwang:你的目標蛋白抓condition，其實不會很麻煩 09/23 21:15
12F：→ aborwang:對了，如果你是要看total lysate的話，我的經驗是 09/23 21:17
13F：→ aborwang:寧願讓大分子protein殘留一些在gel上，只要相對應的 09/23 21:18
14F：推 aborwang:大分子marker大都有明顯的轉到膜上，sample量就差不多了 09/23 21:22
15F：推 rivis:buffer ? 09/23 21:57
16F：推 tsubasawolfy:墊兩張membrane就好了XD 09/23 22:30
17F：推 chingheng:1. transfer過頭了 2.使用孔徑小的membrane(0.2um) 09/23 23:08
18F：→ borhen:謝謝大家~@@ 09/23 23:32