作者borhen (希望梦想成真)
看板Biotech
标题Re: [求救] 有关於SDS-PAGE transfer 的问题
时间Tue Sep 23 21:02:16 2008
※ 引述《borhen (希望梦想成真)》之铭言：
: 有一个问题想向大家请教一下
: 我们实验室是利用半乾式转置槽做protein 转置到membrane
: 发现到一个很怪的现像
: 蛋白质sample为细胞total protein 所以理论上大到小都有
: 1. 我们把转置完的sds-page 拿去染色
: 发现到大分子量的蛋白质 大部分留在membrane上
: 但小分子量的protein都是乾乾净净的
: 甚至放在最下层的3M paper 有发现protein marker的存在
: 请问各位专家 实验到底发生什麽样的事情~@@
: 请大家给点建议~~谢谢
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◆ From: 140.113.173.43
1F：推 aceliang:转渍？09/23 20:07
2F：推 aborwang:protein大小的差异，如果目标蛋白分子量大一点(>100kD)09/23 20:12
3F：→ aborwang:我会延长transfer时间10%~20%09/23 20:13
4F：推 tsubasawolfy:transfer太久小分子亮的protein会跑过membrane..09/23 20:42
5F：→ tsubasawolfy:不过还是要看你membrane材质(孔径) 09/23 20:42
6F：→ tsubasawolfy: 量- - 09/23 20:42
目前最为常用的NC paper 跟 PVDF都有试过~@@
都有这样的现象产生 可是我一直再想~~ protein 太大会残留再SDS-PAGE上
protein 太小transfer太久又会过头
请问你们实验~@@ 有这样的现象吗~~~~ 埃~~~~
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◆ From: 140.113.173.43
7F：推 aborwang:当然也会遇到，所以要针对自己的目标蛋白抓condition 09/23 21:08
8F：→ aborwang:以我的p53为例，使用Millipore的0.45um PVDF 09/23 21:10
9F：→ aborwang:我用每平方公分2mA 半乾式transfer 1hr，若大分子就久点 09/23 21:12
10F：→ aborwang:你不妨先参考membrane说明书的建议时间及安培数，再根据 09/23 21:14
11F：→ aborwang:你的目标蛋白抓condition，其实不会很麻烦 09/23 21:15
12F：→ aborwang:对了，如果你是要看total lysate的话，我的经验是 09/23 21:17
13F：→ aborwang:宁愿让大分子protein残留一些在gel上，只要相对应的 09/23 21:18
14F：推 aborwang:大分子marker大都有明显的转到膜上，sample量就差不多了 09/23 21:22
15F：推 rivis:buffer ? 09/23 21:57
16F：推 tsubasawolfy:垫两张membrane就好了XD 09/23 22:30
17F：推 chingheng:1. transfer过头了 2.使用孔径小的membrane(0.2um) 09/23 23:08
18F：→ borhen:谢谢大家~@@ 09/23 23:32