※ 引述《lail (逃避不是辦法阿)》之銘言： : 借標題順便問 : 我之前是從細胞的染色體DNA當作模板做PCR : 我使用Takara Ex Taq可以得到產物 : 但改用一隻叫做"PfuTurbo"的polymerase就無法得到該片段 : (我確定酵素沒有壞掉,因為針對另一個DNA片段是可以得到產物的) : 我後來是使用Takara的LA Taq(這隻也有校正功能),就得到想要的產物 : 但是我還是不明白,為什麼換一隻酵素,條件不變,就沒有辦法得到產物了 : 有高手可以解釋一下嗎? : 謝謝! 看著看著.. 烏鴉想說 Taq 就 Taq, Taq 是種物種 (Thermus aquaticus), 同物種怎麼會有兩種 DNA polymerase; 怎麼可能生的出來 proofreading 的功能.. 後來查了一下: " Takara LA Taq™ is a mixture of Taq Polymerase with a proofreading polymerase " 說穿了應該是 Taq 混 Pfu 或者 KOD 之類的.. = =" Pfu -> Pyrococcus furiosus, KOD -> Thermocccus kodakaraensis ( http://www.takarabiousa.com/ap/products/details/12 ) 為什麼 Pfu 做不出來原因可能很多種.. 但說不定 LA 那次做出來的大多也都是其中 Taq 的功勞, 說不定裡面能發揮 proofreading 的另一隻 DNA polymerase 完全沒在做事!! ( 如果我是廠商, 當然裡面會放比較多 Taq... XD ) 好啦, 也說不定它是有在矯正錯誤.. (心虛) : ※ 引述《aikawa7090 (小紅)》之銘言： : : 各位大大好，小弟最近在從cDNA做PCR，P出想要的gene，由於片段長度約 : : 700Kb左右，且要的cDNA片段之後再transfect到細胞中看表現的，所以希 : : 望能達到PCR出來的片段不要有任何錯誤^^ : : 目前遇到的問題是，用taq能夠PCR出想要的片段，但是同樣的condition下， : : 用Pfu就PCR不出來，老師建議我用taq做PCR，並加入一點pfu做proofreading， : : 可是一加入pfu就PCR不出來了(連個band都沒有= =) : : 所以想請問大家，有沒有大大手上有廠商的pfu tag mixture的protocol，也就 : : 是PCR的sample成分要如何搭(pfu加多少，taq加多少，dNTP加多少等等) : : 麻煩大家了，感恩~~ 樓主的這種方法烏鴉的實驗室沒做過.. 要嘛, 我們就全都用 Pfu ＝ｗ＝// 不然混用的量那麼少, pipet 也吸不準; 自行稀釋又怕稀釋的不好.. 我們頂多添加 Taq 去加 A 去做 TA-cloning. 不過如果目標是 " 700bp " 而不是 " 700kb " 的話.. ( 烏鴉猜是 700bp 啦.. 不然一個 cycle 光 Extension 就要 700 分鐘以上.. 就算你有耐心等.. 也要一值添加新的 polymerase... ) 烏鴉會建議: 既然能用 Taq 做的出來, 那就用 Taq 吧, Taq 的錯誤率其實也沒那麼高, 1kb 以下應該是撐的過去的. 要 transfect 而不希望序列上有所錯誤應該是要 送定序, 畢竟光切, 接進去都有可能出包.. ( 理論上不會, 但.. 在 UV box 上切膠的時候也是有它突變的機率呀.. ) 多訂一隻 primer, 多送一次定序會比之後實驗都做不出來猛重做來的省錢的. **** 如果老闆很嚴苛, 一定要做做樣子, 他說了就一定要試 A+B.. 或許可以試著自行比較 buffer 那些環境條件著手吧, 這應該比 polymerase 的比例還要嚴苛. 萬一環境不好, Pfu 不做工也就罷了, 還佔著位置不給 Taq 工作那就.. ( 烏鴉是覺得沒有廠商會叫你用 A+B 的, 倘若真要 A+B 他們會去註冊一個商標出一個新產品. \~"~/ ) * Reaction buffer 部分: 理論上每種 polymerase 應該是純化出來該種生物體內的環境 會最適合它們工作, 也就是說若是 Taq 的話應該都要一樣. 但因為每家的 polymerase 儲存方式不同 影響 final; 或者為了推出共通使用的 buffer 而會導致 final 有所不同. 不清楚您用的各是哪家的, 但烏鴉這邊有的 pdf 資料上有.. Stratagene 的 Pfu 跟 Taq buffer 成份是一樣的: 200 mM Tris-HCl (pH 8.8) 20 mM MgSO4 100 mM KCl 100 mM (NH4) 2SO4 1% Triton® X-100 1 mg/ml nuclease-free BSA ( Buffer 會提供 Mg2+ 至 2 mM 的 final 濃度, 但 cDNA 建議提升到 3 mM ) 如果是 Invitrogen 的 Taq 那就只有: 200 mM Tris-HCl (pH 8.4) 500 mM KCl ( Buffer 不提供 Mg2+, 但最終會把 Mg2+ 加到 1.5 mM ) 只能說.. 盡量讓兩隻 polymerase 工作的時候接近他們建議的環境囉 ._. * 鎂離子: 影響 primer 跟 template 的 denature 溫度, 一般來說濃度 越高越好做出東西來; 濃度太高會做出一堆不是你要的東西來. 像您這樣子完全做不出東西來或許可以考慮提高 Mg2+ 的濃度. * dNTP: 這會影響 polymerase 挑選東西接上去的專一性. 增加使用量或許可以讓您做出來, 但濃度太高的時候 polymerase 隨便抓一個就丟上去了, 也就失去您想使用 Pfu 增加正確率的本意了. 還有就是說這如果是您自行用 dATP dTTP dCTP dGTP 混合的, 混合的比例越接近 1:1:1:1 越好. 也是可以減少錯誤率. 後兩個環境條件應該就跟 Pfu 是還是 Taq 比較沒有關係了, 畢竟我們無論是在使用 Pfu 或者 Taq 的時候只要做不出來, 都有可能會去 modify 這兩者. (不過他們的影響力似乎也比較大?!) 隨便打的有點多 有點亂.. 總結一下: 1. 不要錯就要送定序! 2. 硬要做就查個別 polymerase 廠商的 pdf 資料多做比較和推測嘗試吧 ._./ ( 但還是要送定序, 除非你們老闆非常不喜歡送定序.. Orz ) --

※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 125.230.192.176 真的耶, 是 N 端 deletion 然後去接部份的 proofreading polymerase @_@ 也真是特別的東西, 烏鴉只有聽說過用 ab 去讓 Taq 或者 Pfu 這類變得有 hot-start 的效果這種 modify; 居然有直接 modify 基因去賦予 Taq proofreading 的效果.. 真是受教了 <(_ _)> ( http://www.clontech.com/images/pt/PT3281-1.pdf ) 偷偷改一下上面的用詞好了, 免得誤會說 Hot-start 跟 proofreading 是一樣的.. :P Hot-start 是讓 polymerase 在溫度還沒到之前不要工作, 以免在你設定 PCR 機器的時候 polymerase 亂複製東西 ._. (再順道偷推一下 Novagen® KOD Hot Start DNA Polymerase 烏鴉很喜歡這隻 XD) ※ 編輯: Crow22312 來自: 125.230.192.176 (09/23 12:08)