※ 引述《lail (逃避不是办法阿)》之铭言： : 借标题顺便问 : 我之前是从细胞的染色体DNA当作模板做PCR : 我使用Takara Ex Taq可以得到产物 : 但改用一只叫做"PfuTurbo"的polymerase就无法得到该片段 : (我确定酵素没有坏掉,因为针对另一个DNA片段是可以得到产物的) : 我後来是使用Takara的LA Taq(这只也有校正功能),就得到想要的产物 : 但是我还是不明白,为什麽换一只酵素,条件不变,就没有办法得到产物了 : 有高手可以解释一下吗? : 谢谢! 看着看着.. 乌鸦想说 Taq 就 Taq, Taq 是种物种 (Thermus aquaticus), 同物种怎麽会有两种 DNA polymerase; 怎麽可能生的出来 proofreading 的功能.. 後来查了一下: " Takara LA Taq™ is a mixture of Taq Polymerase with a proofreading polymerase " 说穿了应该是 Taq 混 Pfu 或者 KOD 之类的.. = =" Pfu -> Pyrococcus furiosus, KOD -> Thermocccus kodakaraensis ( http://www.takarabiousa.com/ap/products/details/12 ) 为什麽 Pfu 做不出来原因可能很多种.. 但说不定 LA 那次做出来的大多也都是其中 Taq 的功劳, 说不定里面能发挥 proofreading 的另一只 DNA polymerase 完全没在做事!! ( 如果我是厂商, 当然里面会放比较多 Taq... XD ) 好啦, 也说不定它是有在矫正错误.. (心虚) : ※ 引述《aikawa7090 (小红)》之铭言： : : 各位大大好，小弟最近在从cDNA做PCR，P出想要的gene，由於片段长度约 : : 700Kb左右，且要的cDNA片段之後再transfect到细胞中看表现的，所以希 : : 望能达到PCR出来的片段不要有任何错误^^ : : 目前遇到的问题是，用taq能够PCR出想要的片段，但是同样的condition下， : : 用Pfu就PCR不出来，老师建议我用taq做PCR，并加入一点pfu做proofreading， : : 可是一加入pfu就PCR不出来了(连个band都没有= =) : : 所以想请问大家，有没有大大手上有厂商的pfu tag mixture的protocol，也就 : : 是PCR的sample成分要如何搭(pfu加多少，taq加多少，dNTP加多少等等) : : 麻烦大家了，感恩~~ 楼主的这种方法乌鸦的实验室没做过.. 要嘛, 我们就全都用 Pfu ＝ｗ＝// 不然混用的量那麽少, pipet 也吸不准; 自行稀释又怕稀释的不好.. 我们顶多添加 Taq 去加 A 去做 TA-cloning. 不过如果目标是 " 700bp " 而不是 " 700kb " 的话.. ( 乌鸦猜是 700bp 啦.. 不然一个 cycle 光 Extension 就要 700 分钟以上.. 就算你有耐心等.. 也要一值添加新的 polymerase... ) 乌鸦会建议: 既然能用 Taq 做的出来, 那就用 Taq 吧, Taq 的错误率其实也没那麽高, 1kb 以下应该是撑的过去的. 要 transfect 而不希望序列上有所错误应该是要 送定序, 毕竟光切, 接进去都有可能出包.. ( 理论上不会, 但.. 在 UV box 上切胶的时候也是有它突变的机率呀.. ) 多订一只 primer, 多送一次定序会比之後实验都做不出来猛重做来的省钱的. **** 如果老板很严苛, 一定要做做样子, 他说了就一定要试 A+B.. 或许可以试着自行比较 buffer 那些环境条件着手吧, 这应该比 polymerase 的比例还要严苛. 万一环境不好, Pfu 不做工也就罢了, 还占着位置不给 Taq 工作那就.. ( 乌鸦是觉得没有厂商会叫你用 A+B 的, 倘若真要 A+B 他们会去注册一个商标出一个新产品. \~"~/ ) * Reaction buffer 部分: 理论上每种 polymerase 应该是纯化出来该种生物体内的环境 会最适合它们工作, 也就是说若是 Taq 的话应该都要一样. 但因为每家的 polymerase 储存方式不同 影响 final; 或者为了推出共通使用的 buffer 而会导致 final 有所不同. 不清楚您用的各是哪家的, 但乌鸦这边有的 pdf 资料上有.. Stratagene 的 Pfu 跟 Taq buffer 成份是一样的: 200 mM Tris-HCl (pH 8.8) 20 mM MgSO4 100 mM KCl 100 mM (NH4) 2SO4 1% Triton® X-100 1 mg/ml nuclease-free BSA ( Buffer 会提供 Mg2+ 至 2 mM 的 final 浓度, 但 cDNA 建议提升到 3 mM ) 如果是 Invitrogen 的 Taq 那就只有: 200 mM Tris-HCl (pH 8.4) 500 mM KCl ( Buffer 不提供 Mg2+, 但最终会把 Mg2+ 加到 1.5 mM ) 只能说.. 尽量让两只 polymerase 工作的时候接近他们建议的环境罗 ._. * 镁离子: 影响 primer 跟 template 的 denature 温度, 一般来说浓度 越高越好做出东西来; 浓度太高会做出一堆不是你要的东西来. 像您这样子完全做不出东西来或许可以考虑提高 Mg2+ 的浓度. * dNTP: 这会影响 polymerase 挑选东西接上去的专一性. 增加使用量或许可以让您做出来, 但浓度太高的时候 polymerase 随便抓一个就丢上去了, 也就失去您想使用 Pfu 增加正确率的本意了. 还有就是说这如果是您自行用 dATP dTTP dCTP dGTP 混合的, 混合的比例越接近 1:1:1:1 越好. 也是可以减少错误率. 後两个环境条件应该就跟 Pfu 是还是 Taq 比较没有关系了, 毕竟我们无论是在使用 Pfu 或者 Taq 的时候只要做不出来, 都有可能会去 modify 这两者. (不过他们的影响力似乎也比较大?!) 随便打的有点多 有点乱.. 总结一下: 1. 不要错就要送定序! 2. 硬要做就查个别 polymerase 厂商的 pdf 资料多做比较和推测尝试吧 ._./ ( 但还是要送定序, 除非你们老板非常不喜欢送定序.. Orz ) --

※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc) ◆ From: 125.230.192.176 真的耶, 是 N 端 deletion 然後去接部份的 proofreading polymerase @_@ 也真是特别的东西, 乌鸦只有听说过用 ab 去让 Taq 或者 Pfu 这类变得有 hot-start 的效果这种 modify; 居然有直接 modify 基因去赋予 Taq proofreading 的效果.. 真是受教了 <(_ _)> ( http://www.clontech.com/images/pt/PT3281-1.pdf ) 偷偷改一下上面的用词好了, 免得误会说 Hot-start 跟 proofreading 是一样的.. :P Hot-start 是让 polymerase 在温度还没到之前不要工作, 以免在你设定 PCR 机器的时候 polymerase 乱复制东西 ._. (再顺道偷推一下 Novagen® KOD Hot Start DNA Polymerase 乌鸦很喜欢这只 XD) ※ 编辑: Crow22312 来自: 125.230.192.176 (09/23 12:08)