作者bbiioo (梅子)
看板Biotech
標題[求救] CIAP之使用
時間Sun Sep 21 14:05:39 2008
想要進行Ligation
載體是用pET-29
我的限制酶切點是 Nde I & HindIII
想要利用CIAP去作用，以免載體自黏
請問~
是要作用vector就好嗎??insert需要用CIAP處理嗎?
還有 作用順序上
是vector用酵素切完之後(我是用double digestion)
再用CIAP去作用嗎??
已經卡在這地方好久了
正在找出可能的問題點
酵素cleavage的部分 應該是有切動
所以~猜測是在ligation的部分沒接上去
都是載體自黏的...
所以才想說試試CIAP
希望有經驗的大大們!!
幫我解個答吧!!感恩感恩~多謝多謝了
--
※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 140.130.38.65
1F：推 tsubasawolfy:其實仔細想想CIAP的作用 你的問題就可以迎刃而解 Orz 09/21 14:11
2F：→ bbiioo:恕我愚笨...作用機制大概了解，不過想再釐清一點 謝了 09/21 14:25
3F：推 magicaries:vertor就好 09/21 14:37
4F：→ magicaries:vector 09/21 14:37
5F：推 tsubasawolfy:痾 沒有嘲弄的意思Orz 只是假設insert的P也拿掉 09/21 15:42
6F：→ tsubasawolfy:那他要如何跟P也拿掉的vector接合 另外在未切開的V中 09/21 15:43
7F：→ tsubasawolfy:加入CIAP 他找不到P位置也就沒作用吧Orz 09/21 15:43
8F：→ bbiioo:恩恩!!!了解 感謝了 09/21 17:03
9F：推 yaliu:其實兩端切點不同，有必要做CIP嗎？？ 09/21 17:47
10F：推 yaliu:轉型過後check tansformants他們都是載體自黏嗎？ 09/21 18:02
11F：→ yaliu:那你覺得有沒有可能是有一個酵素其實沒有切動？兩個切點有 09/21 18:03
12F：推 yaliu:靠很近嗎？要不要分兩次切....？ 09/21 18:05
13F：→ bbiioo:因為check後!就只有一條band且是剛好載體的大小所以 09/21 18:57
14F：→ bbiioo:應該是載體自黏了 09/21 18:58
15F：→ bbiioo:至於有酵素沒切動..也是我擔心的地方~insert切點距離1.5KB 09/21 18:59
16F：→ bbiioo:分兩次切..也試過了.結果還是一樣沒接上 09/21 19:00
17F：→ bbiioo:會想作CIAP是因為~不知道下一步該怎麼走了..才想說用它試試 09/21 19:01
18F：推 hibioman:CIAP活性很強、不易去除 09/21 20:24
19F：推 yaliu:check有沒有切動如果是我的話，我會做對照。1).NdeI切 09/21 22:33
20F：→ yaliu:2).HindIII切，3).兩個一起切。三個都要能切動才行 09/21 22:34
21F：→ yaliu:當然兩個酵素一起切，buffer要都適用....我覺得切點不同自接 09/21 22:35
22F：→ yaliu:機率應該很低......問一下你的transformants多嗎？ 09/21 22:36
23F：推 blence:大部分人都是從MCS切兩刀,就算有單切對照跑gel,通常都看不 09/21 22:50
24F：→ blence:出差異,除非是transform方式來確認,但這就樣更複雜麻煩了 09/21 22:52
25F：→ blence:除非少有挑到vector only,不然加CIP只要0.5~1h方便不麻煩 09/21 22:54
26F：→ bbiioo:我的Transformant不多. 09/22 08:22
27F：→ bbiioo:想問一下 vector only是指說~接出來的只有vector沒insert? 09/22 08:24
28F：推 tsubasawolfy:Blence的意思是實驗組挑到vector selflifation情況 09/22 08:41
29F：→ tsubasawolfy:極少(在有CIAP條件下) 要確認CIAP是否做用完全就另外 09/22 08:42
30F：→ tsubasawolfy:把CIAP處理完的vector一樣ligation後transform 09/22 08:43
31F：→ tsubasawolfy:通常只會長個位數顆甚至沒有(前提是enzyme要作用完全 09/22 08:44
32F：→ bbiioo:OKOK有了解了!!謝謝唷 09/22 09:01
33F：推 sGoat:vector ligation前,55度加熱5分鐘後再使用即可 09/23 10:58
34F：推 sGoat:不需使用到CIAP,前提是有切乾淨的情形下 09/23 11:02
35F：推 yaliu:對後～～我終於知道為什麼我會覺得自接機率低了 09/23 15:38
36F：→ yaliu:因為我總是enzyme加多，作用時間加長，確保切的乾淨 09/23 15:38
37F：→ yaliu:我製備的vector發生自接機率蠻低的XD 09/23 15:39