作者bbiioo (梅子)
看板Biotech
标题[求救] CIAP之使用
时间Sun Sep 21 14:05:39 2008
想要进行Ligation
载体是用pET-29
我的限制酶切点是 Nde I & HindIII
想要利用CIAP去作用，以免载体自黏
请问~
是要作用vector就好吗??insert需要用CIAP处理吗?
还有 作用顺序上
是vector用酵素切完之後(我是用double digestion)
再用CIAP去作用吗??
已经卡在这地方好久了
正在找出可能的问题点
酵素cleavage的部分 应该是有切动
所以~猜测是在ligation的部分没接上去
都是载体自黏的...
所以才想说试试CIAP
希望有经验的大大们!!
帮我解个答吧!!感恩感恩~多谢多谢了
--
※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 140.130.38.65
1F：推 tsubasawolfy:其实仔细想想CIAP的作用 你的问题就可以迎刃而解 Orz 09/21 14:11
2F：→ bbiioo:恕我愚笨...作用机制大概了解，不过想再厘清一点 谢了 09/21 14:25
3F：推 magicaries:vertor就好 09/21 14:37
4F：→ magicaries:vector 09/21 14:37
5F：推 tsubasawolfy:痾 没有嘲弄的意思Orz 只是假设insert的P也拿掉 09/21 15:42
6F：→ tsubasawolfy:那他要如何跟P也拿掉的vector接合 另外在未切开的V中 09/21 15:43
7F：→ tsubasawolfy:加入CIAP 他找不到P位置也就没作用吧Orz 09/21 15:43
8F：→ bbiioo:恩恩!!!了解 感谢了 09/21 17:03
9F：推 yaliu:其实两端切点不同，有必要做CIP吗？？ 09/21 17:47
10F：推 yaliu:转型过後check tansformants他们都是载体自黏吗？ 09/21 18:02
11F：→ yaliu:那你觉得有没有可能是有一个酵素其实没有切动？两个切点有 09/21 18:03
12F：推 yaliu:靠很近吗？要不要分两次切....？ 09/21 18:05
13F：→ bbiioo:因为check後!就只有一条band且是刚好载体的大小所以 09/21 18:57
14F：→ bbiioo:应该是载体自黏了 09/21 18:58
15F：→ bbiioo:至於有酵素没切动..也是我担心的地方~insert切点距离1.5KB 09/21 18:59
16F：→ bbiioo:分两次切..也试过了.结果还是一样没接上 09/21 19:00
17F：→ bbiioo:会想作CIAP是因为~不知道下一步该怎麽走了..才想说用它试试 09/21 19:01
18F：推 hibioman:CIAP活性很强、不易去除 09/21 20:24
19F：推 yaliu:check有没有切动如果是我的话，我会做对照。1).NdeI切 09/21 22:33
20F：→ yaliu:2).HindIII切，3).两个一起切。三个都要能切动才行 09/21 22:34
21F：→ yaliu:当然两个酵素一起切，buffer要都适用....我觉得切点不同自接 09/21 22:35
22F：→ yaliu:机率应该很低......问一下你的transformants多吗？ 09/21 22:36
23F：推 blence:大部分人都是从MCS切两刀,就算有单切对照跑gel,通常都看不 09/21 22:50
24F：→ blence:出差异,除非是transform方式来确认,但这就样更复杂麻烦了 09/21 22:52
25F：→ blence:除非少有挑到vector only,不然加CIP只要0.5~1h方便不麻烦 09/21 22:54
26F：→ bbiioo:我的Transformant不多. 09/22 08:22
27F：→ bbiioo:想问一下 vector only是指说~接出来的只有vector没insert? 09/22 08:24
28F：推 tsubasawolfy:Blence的意思是实验组挑到vector selflifation情况 09/22 08:41
29F：→ tsubasawolfy:极少(在有CIAP条件下) 要确认CIAP是否做用完全就另外 09/22 08:42
30F：→ tsubasawolfy:把CIAP处理完的vector一样ligation後transform 09/22 08:43
31F：→ tsubasawolfy:通常只会长个位数颗甚至没有(前提是enzyme要作用完全 09/22 08:44
32F：→ bbiioo:OKOK有了解了!!谢谢唷 09/22 09:01
33F：推 sGoat:vector ligation前,55度加热5分钟後再使用即可 09/23 10:58
34F：推 sGoat:不需使用到CIAP,前提是有切乾净的情形下 09/23 11:02
35F：推 yaliu:对後～～我终於知道为什麽我会觉得自接机率低了 09/23 15:38
36F：→ yaliu:因为我总是enzyme加多，作用时间加长，确保切的乾净 09/23 15:38
37F：→ yaliu:我制备的vector发生自接机率蛮低的XD 09/23 15:39