作者veltine (Time go by~~~)
看板Biotech
標題Re: [求救]利用共軛顯微鏡觀察細胞內鈣離子的實驗方法
時間Tue Sep 16 15:05:40 2008
※ 引述《JinMinHo0626 (痴呆的小老虎~~MinHo)》之銘言：
: 昨天我將已經seeging在3.5cm dish的HEK293細胞
: 加入 1 ul 5mM fluo-3-AM + 2ul 10% Pluronic F-127(in water)
: 於總體積1ml Kerbs-Henseleit buffer 中37度避光染色45分鐘
: 之後以Kerbs-Henseleit buffer 清洗三次
: 再加入Kerbs-Henseleit buffer 1 ml 於37度靜置30分鐘
: 這個實驗是模仿2003 JBC paper
: paper上說當加入methacholine刺激時
: HEK293細胞內的鈣離子就會變化
: 現在我遇到的問題就是
: 當昨天要先用488波長去看細胞有沒有染到fluo-3時
: 在細胞上完全看不到綠色螢光
: 幫我的老師是說連染劑都沒有成功進入細胞
: 他是說是因為10% Pluronic F-127是溶在水中
: 而非DMSO 造成無法把flro-3-am完全均勻溶解
: 且成功帶入細胞
: 我想問的是:
: 1.DMSO的含量真的會關係到染劑能否進入細胞嗎?
在無聊的等實驗的時間幫你查了一下…
Pluronic F-127是nonionic, surfactant polyol的東西
主要目的是幫非水溶性的dye溶解於水中
Typically, a small volume of the AM ester, dissolved
at 1–5 mM in DMSO, is mixed with the 20% (w/v)
Pluronic F-127 stock solution in DMSO at a ratio of
1:1 immediately before use.
上面是catalog說的…所以你的fluo-3上有AM ester，應該
不好溶水吧…
有一個小技巧---你可先把fluo-3和Pluronic F-127先加在
一起，體積很小只有2μl，放個2-3分鐘幫助fluo-3溶解，
再把你的1ml buffer加到tube中…
但是以上我是用fluo-4做實驗的，細胞是microglia…
而fluo-4是用Probenecid溶的…呵呵
不負責任經驗，供你參考…Orz
: 2.上面所做的protocol是不是有誤?
: 3.還有更好的方法或比例可以幫助fluo-3混合均勻/增加細胞染色效率?
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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 134.76.207.1
1F：推 JinMinHo0626:非常謝謝你,那可不可以跟你詢問FLUO-4的染色protocol 09/16 15:44
2F：→ JinMinHo0626:呢?不知道方不方便...謝謝你喔 09/16 15:46
3F：→ veltine:這是我三年前做的實驗…protocol就是你打的那樣子… 09/16 16:03
4F：→ veltine:sorry...我也沒寫下來…全是依照data sheet上做的… 09/16 16:04
5F：推 JinMinHo0626:沒關係,還是謝謝你,那可以問Probenecid是溶於DMSO? 09/16 16:27
6F：→ veltine:抱歉我搞錯了…fluo-4也是Pluronic溶的，Probenecid是另 09/16 17:11
7F：→ veltine:一種kit… 09/16 17:11