作者veltine (Time go by~~~)
看板Biotech
标题Re: [求救]利用共轭显微镜观察细胞内钙离子的实验方法
时间Tue Sep 16 15:05:40 2008
※ 引述《JinMinHo0626 (痴呆的小老虎~~MinHo)》之铭言：
: 昨天我将已经seeging在3.5cm dish的HEK293细胞
: 加入 1 ul 5mM fluo-3-AM + 2ul 10% Pluronic F-127(in water)
: 於总体积1ml Kerbs-Henseleit buffer 中37度避光染色45分钟
: 之後以Kerbs-Henseleit buffer 清洗三次
: 再加入Kerbs-Henseleit buffer 1 ml 於37度静置30分钟
: 这个实验是模仿2003 JBC paper
: paper上说当加入methacholine刺激时
: HEK293细胞内的钙离子就会变化
: 现在我遇到的问题就是
: 当昨天要先用488波长去看细胞有没有染到fluo-3时
: 在细胞上完全看不到绿色萤光
: 帮我的老师是说连染剂都没有成功进入细胞
: 他是说是因为10% Pluronic F-127是溶在水中
: 而非DMSO 造成无法把flro-3-am完全均匀溶解
: 且成功带入细胞
: 我想问的是:
: 1.DMSO的含量真的会关系到染剂能否进入细胞吗?
在无聊的等实验的时间帮你查了一下…
Pluronic F-127是nonionic, surfactant polyol的东西
主要目的是帮非水溶性的dye溶解於水中
Typically, a small volume of the AM ester, dissolved
at 1–5 mM in DMSO, is mixed with the 20% (w/v)
Pluronic F-127 stock solution in DMSO at a ratio of
1:1 immediately before use.
上面是catalog说的…所以你的fluo-3上有AM ester，应该
不好溶水吧…
有一个小技巧---你可先把fluo-3和Pluronic F-127先加在
一起，体积很小只有2μl，放个2-3分钟帮助fluo-3溶解，
再把你的1ml buffer加到tube中…
但是以上我是用fluo-4做实验的，细胞是microglia…
而fluo-4是用Probenecid溶的…呵呵
不负责任经验，供你参考…Orz
: 2.上面所做的protocol是不是有误?
: 3.还有更好的方法或比例可以帮助fluo-3混合均匀/增加细胞染色效率?
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※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 134.76.207.1
1F：推 JinMinHo0626:非常谢谢你,那可不可以跟你询问FLUO-4的染色protocol 09/16 15:44
2F：→ JinMinHo0626:呢?不知道方不方便...谢谢你喔 09/16 15:46
3F：→ veltine:这是我三年前做的实验…protocol就是你打的那样子… 09/16 16:03
4F：→ veltine:sorry...我也没写下来…全是依照data sheet上做的… 09/16 16:04
5F：推 JinMinHo0626:没关系,还是谢谢你,那可以问Probenecid是溶於DMSO? 09/16 16:27
6F：→ veltine:抱歉我搞错了…fluo-4也是Pluronic溶的，Probenecid是另 09/16 17:11
7F：→ veltine:一种kit… 09/16 17:11