作者dreamysky (新綠園說不關了)
看板Biotech
標題Re: [方法] ligation的問題...
時間Mon Sep 15 01:01:43 2008
※ 引述《dreamysky (新綠園說不關了)》之銘言：
: 標題: [方法] ligation的問題...
: 時間: Sat Sep 13 16:24:28 2008
:
: 我有一段要接進去的gene 大小約1K
:
: 可是他的前後接位都是EcoR1
:
: vector 我有加CIAP 作用 37度 30 min
:
: ligation volume控制在20 ul
:
: mol為 Vector: 0.7 pmol
: gene : 6 pmol
:
: 2 unit T4 ligase (genemark)
: --
:
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: ◆ From: 192.192.90.35
: 推 enisx:我都做5 uL而耶... 16 度 overnight 09/13 16:39
: 推 dankai:試試看overnight! 還有genemark的ligase我認為效率不太高~ 09/13 16:50
: → dankai:跟promega比起來~我比較喜歡用promega~~呵! 09/13 16:51
: 推 veltine:看看ligation buffer有沒有沉澱…另外加ATP試試看… 09/13 17:21
: 推 feng760804:OVERNIGHT+1 09/13 23:54
: 推 ookubo:請問一下 你的接不進去 是怎樣判定的？ 09/13 23:59
我是做四度C O/N
不是PCR 產物
是從A vector 切下來接到B vector
因為濃度的關係
我沒辦法做到E大說的5 ul
我比較擔心的是ATP
要怎麼回溫比較不會degrade?
我是拿一部分來做BamH1 & Nde1 digestion判定有沒有接進去
有沒有接進去有1K的差距
至於是順接還是反接我會用Sac1來判定
我今天看了一下好像有兩個colonies有接進去
明天做進一步確認
此外我也會確認一下ATP跟溫度
可能之後會做16度 O/N
謝謝各位前輩指教
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1F：推 yaliu:ligation buffer必須要在冰上回溫喔～～另外，避免因為多次 09/15 01:08
2F：→ yaliu:回溫造成ATP degrade，可以先分裝小管使用 09/15 01:09
3F：推 dankai:對了~genemark的ligase buffer中不含ATP~它是另外一管要注 09/15 14:12
4F：→ dankai:意一下! 加油~~ 09/15 14:13
5F：→ dreamysky:我就是那管被我亂搞了~我想應該是我對ATP太粗魯了 09/15 16:51