作者dreamysky (新绿园说不关了)
看板Biotech
标题Re: [方法] ligation的问题...
时间Mon Sep 15 01:01:43 2008
※ 引述《dreamysky (新绿园说不关了)》之铭言：
: 标题: [方法] ligation的问题...
: 时间: Sat Sep 13 16:24:28 2008
:
: 我有一段要接进去的gene 大小约1K
:
: 可是他的前後接位都是EcoR1
:
: vector 我有加CIAP 作用 37度 30 min
:
: ligation volume控制在20 ul
:
: mol为 Vector: 0.7 pmol
: gene : 6 pmol
:
: 2 unit T4 ligase (genemark)
: --
:
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: ◆ From: 192.192.90.35
: 推 enisx:我都做5 uL而耶... 16 度 overnight 09/13 16:39
: 推 dankai:试试看overnight! 还有genemark的ligase我认为效率不太高~ 09/13 16:50
: → dankai:跟promega比起来~我比较喜欢用promega~~呵! 09/13 16:51
: 推 veltine:看看ligation buffer有没有沉淀…另外加ATP试试看… 09/13 17:21
: 推 feng760804:OVERNIGHT+1 09/13 23:54
: 推 ookubo:请问一下 你的接不进去 是怎样判定的？ 09/13 23:59
我是做四度C O/N
不是PCR 产物
是从A vector 切下来接到B vector
因为浓度的关系
我没办法做到E大说的5 ul
我比较担心的是ATP
要怎麽回温比较不会degrade?
我是拿一部分来做BamH1 & Nde1 digestion判定有没有接进去
有没有接进去有1K的差距
至於是顺接还是反接我会用Sac1来判定
我今天看了一下好像有两个colonies有接进去
明天做进一步确认
此外我也会确认一下ATP跟温度
可能之後会做16度 O/N
谢谢各位前辈指教
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1F：推 yaliu:ligation buffer必须要在冰上回温喔～～另外，避免因为多次 09/15 01:08
2F：→ yaliu:回温造成ATP degrade，可以先分装小管使用 09/15 01:09
3F：推 dankai:对了~genemark的ligase buffer中不含ATP~它是另外一管要注 09/15 14:12
4F：→ dankai:意一下! 加油~~ 09/15 14:13
5F：→ dreamysky:我就是那管被我乱搞了~我想应该是我对ATP太粗鲁了 09/15 16:51