作者hsin1106 (過於喧囂的孤獨)
看板Biotech
標題Re: [求救] 抽DNA跟跑電泳的問題
時間Thu Sep 11 19:36:00 2008
※ 引述《yaliu (雅)》之銘言：
: ※ 引述《hsin1106 (過於喧囂的孤獨)》之銘言：
: : 最近剛進實驗室開始做實驗
: : 在抽DNA跑agarose gel時碰到了幾個問題
: : 1.我的gel照UV的時候 頂端會整個偏白色
: : 比較上面的band會被蓋過去 不容易判讀
: 會不會buffer太髒，或者gel配太久了？？
gel都是 現做的 1%
buffer的話是公用的
: 如果片段太大可以降低agarose ％數
: : 2.用BamH和NdeI切我的plasmid時
: : 我的比例是 兩種酵素 各加1μl
: : DNA 7μl 跟 1μl 10X 的buffer
: : DNA量比較多的話就等比例增加
: : 之後再37度下反應兩個小時
: : 可是跑完電泳 甚麼都看不到
: : (marker跟未切拿來當control的都有band)
: 各loading的量？
: 未切的和已切的各loading多少？
通常我都會loading一樣的量
loading過10μl跟20μl兩個量
: : 3.我的plasmid 是pET-15b
: : 通常在菌液OD=1.5上下時用VIOGENE的kit抽
: : 抽出來的DNA稀釋10倍測260nm大概都在0.03~0.05之間
: : 這樣的量是不是偏少?? 是的話 有哪些可能會影響??
: 濃度應該用核酸測定儀測吧
: 不然可以對照marker的量
: 記憶上以前測過1mL的菌液萃取，好像頂多0.6~0.9 ug/ul吧
: 好像很難超過 1ug/ul (不曉得有沒有記錯.....)
: 我是用kit抽的
: 還有plasmid的量跟copy number應該有關吧
我算了一下我抽的大概只有0.02ug/ul
這樣應該超少的吧...orz
那copy number該怎麼查相關資訊
: : 麻煩板上的各位 提供可能的原因
: : 或者有哪些資料可以參考的
: : 讓我可以試著排除問題
: : 不然實驗一整個沒辦法繼續下去
: : 先謝謝各位了
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◆ From: 163.15.177.142
1F：推 milkpa:pBR322 ori，中間偏低，約10～20copy number 09/11 20:47
2F：推 yaliu:基本上切過的可以全load啦～不過你template其實加的蠻多的耶 09/11 23:15
3F：→ yaliu:問一下，你沒切過的跑電泳亮嗎？ 09/11 23:16
4F：→ yaliu:如果本身plasmid濃度低的話，做酵素切割template在提高 09/11 23:17
5F：推 yaliu:另外，如果你有發現你的plasmid有越抽越少的趨勢，檢查一下 09/11 23:22
6F：→ yaliu:你的抗生素還在不在... 09/11 23:23
7F：→ hsin1106:沒切過的跑電泳會亮...@@ 09/12 10:59
8F：→ feng760804:膠最好不要現做現用喔 最好事先放進烘箱 因為膠太熱 09/13 23:47
9F：→ feng760804:會導致EtBr的降解喔(老闆說的) 09/13 23:48