作者sleepyday (Part time研究生~)
看板Biotech
標題[求救] 會產生雜band的primer會讓定序失敗嗎?
時間Sun Aug 31 19:19:44 2008
先說,
我的primers不會在目標基因中段裡面有互補,只會在頭尾有,
但我用這組primers去p經純化後的gene卻仍然會產生雜band(size較小),
那我想請問,如果我用這組primers來定序目標基因的話,
會造成全段序列無法定完嗎?
因為我之前送過一批定序,
是把目標基因經過pcr後跑膠切band回溶等處理,再送定序,
但結果卻都定不完全長,定序圖上後面peak都消失不見了,
雖然當初送的sample濃度似乎有點低,
但我想問,是否定序失敗也可能是因為這組primers所導致的呢?
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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 61.64.142.62
1F：推 dankai:你第一個問題!既然有雜band你再拿那組paimer去定的話~一定 08/31 19:35
2F：→ dankai:是雜訊!!! 第二個問題~ 你的band多大~大部分定序公司都會 08/31 19:36
3F：→ dankai:說~他們機器大約只能定出多少大小的序列!一般為800左右 08/31 19:37
4F：→ dankai:所以比較大的序列都會定兩端去接!或者再送中間的引子去定~ 08/31 19:38
5F：推 qqo8855436:有雜band有可能會影響結果，2端都分別試看看 08/31 19:44
6F：→ sleepyday:目標大約1100bp,我有用兩頭去定,但都不到300就沒訊了, 08/31 19:58
7F：→ sleepyday:其中FP是我自己設計,但RP是別人paper寫的,他們也做定序, 08/31 19:58
8F：→ sleepyday:所以想說如果問題是在primer,那我就乾脆FPRP都用他們的. 08/31 19:58
9F：→ sleepyday:anyway,thanks~~~ 08/31 20:00
10F：推 bider:定序時還要再用其中一股primer在p一次 應該會更亂.. 08/31 20:28
11F：推 dankai:我建議是提高template濃度再試試!參考看看吧! 08/31 20:30
13F：推 weric0207:建議condition test 提高PCR溫度 雜Band會影響結果判讀 09/04 16:20
14F：→ weric0207:Gel extractiona沒純化好 也會有所影響 09/04 16:22
15F：推 weric0207:不然設計兩對primer來overlap這個基因 09/04 16:26