※ 引述《bbiioo (梅子)》之銘言： : 最近一個約1.5kb的片刻要表現 : 是用pET-29進行Ligation : 切位是 NdeI & XhoI : 我是兩種酵素同時去切，再接 : 轉形後!! : 也有長出菌株 : 可是抽出的質體 : 我再用酵素cleavage確定有沒接上 : 可是...就是切不出我要的(size不對...) : 問的結果說是可能當初就沒切好 : 不然就是沒接上 : 想請問...到底可能是哪裡出問題了?? : 是不是一定要分開切?? : 麻煩大家幫我一下了!!謝謝 (1)設計具有酵素切位的primer，請上NEB網頁上的Cleavage Close to the End of DNA Fragments查詢，除了加入酵素切位序列外，記得還要多加1個或2個以上的 base pair，以利酵素進行切割。(我猜的理由：讓酵素有地方bind進行切割) (2)double digestion，依據每個實驗室使用酵素的不同，可以上網查查該公司的網 頁或是catalog，上面會有double digestion table，假如使用double digestion 請digest overnight。(幫你查過了，假如是NEB-buffer 4或是fermentas-Buffer O 　 這兩個酵素可以同時下去切) (3)也幫你看過pET-29 vector，兩個切位很遠，所以可以切的開。(假如你的vector沒有被modified) (4)不知道你是什麼酵素進行check？假如你是用設計primer的Ndel和XhoI切的話， 　　片段不對，代表你PCR沒amplify你的target gene，請重新確認你的PCR產物。 (5)不一定要分開切，但是分開切效果會比一起切好，只是你需要再多花時間。 FYI --

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