※ 引述《bbiioo (梅子)》之铭言： : 最近一个约1.5kb的片刻要表现 : 是用pET-29进行Ligation : 切位是 NdeI & XhoI : 我是两种酵素同时去切，再接 : 转形後!! : 也有长出菌株 : 可是抽出的质体 : 我再用酵素cleavage确定有没接上 : 可是...就是切不出我要的(size不对...) : 问的结果说是可能当初就没切好 : 不然就是没接上 : 想请问...到底可能是哪里出问题了?? : 是不是一定要分开切?? : 麻烦大家帮我一下了!!谢谢 (1)设计具有酵素切位的primer，请上NEB网页上的Cleavage Close to the End of DNA Fragments查询，除了加入酵素切位序列外，记得还要多加1个或2个以上的 base pair，以利酵素进行切割。(我猜的理由：让酵素有地方bind进行切割) (2)double digestion，依据每个实验室使用酵素的不同，可以上网查查该公司的网 页或是catalog，上面会有double digestion table，假如使用double digestion 请digest overnight。(帮你查过了，假如是NEB-buffer 4或是fermentas-Buffer O 　 这两个酵素可以同时下去切) (3)也帮你看过pET-29 vector，两个切位很远，所以可以切的开。(假如你的vector没有被modified) (4)不知道你是什麽酵素进行check？假如你是用设计primer的Ndel和XhoI切的话， 　　片段不对，代表你PCR没amplify你的target gene，请重新确认你的PCR产物。 (5)不一定要分开切，但是分开切效果会比一起切好，只是你需要再多花时间。 FYI --

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