作者vita221 (vita)
看板Biotech
標題[求救]請問10公分的dish可以加多少lysis buffer下去刮呢?
時間Fri Aug 29 16:37:12 2008
最近開始收細胞要跑磷酸化的蛋白質
上一次做的時候發現 若先用PBS刮下細胞離心後再加lysis buffer
測蛋白質濃度時 蛋白質的量非常的少
因為要做time course的實驗
所以收下來的細胞泡在PBS裡的時間比較長
所以我在想是不是因為這樣 所以蛋白質被分解掉了
所以想請問大大們
如果我直接加lysis buffer的話
要加多少的量下去刮呢?
或者是有其他更好的方法呢?
謝謝!!!
--
※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 192.192.90.33
1F：推 veltine:以我的經驗而言，time course一到，就會把dish放在冰上， 08/29 16:41
2F：→ veltine:吸掉medium，用PBS wash兩次，之後再加入30-50μl的lysis 08/29 16:42
3F：→ veltine:buffer，而我用的dish是35mm的…細胞數有點忘了，但是夠跑 08/29 16:44
4F：→ veltine:WB至少兩次(一次20μg)… 08/29 16:45
5F：→ veltine:但是你先用PBS刮下細胞離心後再加lysis buffer…有可能在 08/29 16:46
6F：→ veltine:你刮下細胞的同時就把細胞給打破了，而protein跑到PBS， 08/29 16:48
7F：→ veltine:這樣子的話測出來的濃度就很少了，或者是你的treatment會 08/29 16:48
8F：→ veltine:會使細胞死亡，protein的量也會減少… 08/29 16:49
9F：→ veltine:事實上，在你用PBS wash細胞，再吸掉的同時，不會完全的吸 08/29 16:51
10F：→ veltine:PBS，所以當你再加入lysis buffer的量，就要考慮一下了… 08/29 16:52
11F：推 blence:很多lab都刮下後wash完再lyse,顯然會lose是操作上差異造成 08/29 17:06
12F：→ blence:還有如果要考量殘餘PBS來斟酌lysis bu,不擔心濃度不對嗎？ 08/29 17:08
13F：推 veltine:呵呵…不過前實驗室的做法是這樣…也跑的出來… 08/29 17:20
14F：推 tsubasawolfy:treatment會造成細胞lose養多盤一點就解決了 08/29 17:21
15F：→ veltine:所以…我想這是結果論吧…假如能成功完成實驗…就是好方法 08/29 17:21
16F：→ tsubasawolfy:我養４盤10cm dish還經過IP.磷酸蛋白一樣可以偵測到 08/29 17:22
17F：→ veltine:考量殘餘PBS來斟酌lysis buffer，是指10mm dish殘留量會高 08/29 17:22
18F：→ tsubasawolfy:不過這是OE蛋白 要偵測正常蛋白的磷酸會加到10盤 08/29 17:23
19F：→ veltine:些，所以要protein濃度高一些相對體積要少一些… 08/29 17:23
20F：→ tsubasawolfy:另外PBS是可以完全吸乾 wash時轉到eppendorf再用 08/29 17:24
21F：→ veltine:不擔心濃度不對？跑之前不是會測濃度嗎？不太懂這個疑問… 08/29 17:24
22F：→ tsubasawolfy:suction抽乾就好 08/29 17:25
23F：→ tsubasawolfy:不過比較好奇做time course為何不立即加入lysis後再 08/29 17:27
24F：→ tsubasawolfy:凍到-80 還要泡在PBS理?? 這樣不是會讓細胞代謝繼續? 08/29 17:27
25F：推 blence:回v,任何lysis bu都有配方濃度,在dish直接作用肯定會受PBS 08/29 17:33
26F：→ blence:大大影響salt,detergent濃度除非在tube才降低PBS影響至最低 08/29 17:35
27F：推 veltine:所以這就是實驗啦~~黑貓白貓能捉到老鼠的就是好貓~~呵呵 08/29 17:38
28F：→ blence:至於t提到磷酸化,一般商業化P抗體要是這樣,可能很難賣出去 08/29 17:39
29F：推 tsubasawolfy:XD 10盤量是因為本身seeding時有控制數目 藥物處理後 08/29 17:47
30F：→ tsubasawolfy:又純收貼附細胞 外加要求一次sample至少可以跑三次 08/29 17:47
31F：→ tsubasawolfy:實驗條件case by case 08/29 17:48
32F：推 blence:除非做IP-mass spec,如果做w還要用這麼多盤,真的建議你找代 08/29 20:37
33F：→ blence:理商求技術支援,或藉以詢問用過此磷抗的lab,不然這太可憐了 08/29 20:39
34F：推 tsubasawolfy:是w->mass沒錯- -a 08/29 21:09
35F：→ tsubasawolfy:另外我局的protein多收有益無害吧? 一次就壓出來總 08/29 21:10
36F：→ tsubasawolfy:每次都拿一咪咪試不出來好 08/29 21:11
37F：推 stephennext:可以加到60 ml, 快滿但是不會滿出來 08/30 00:19
38F：推 LIAR:各位高手，能用回文的方式嗎？t和v兩人竟然還一行夾一行... 08/30 23:56