作者vita221 (vita)
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标题[求救]请问10公分的dish可以加多少lysis buffer下去刮呢?
时间Fri Aug 29 16:37:12 2008
最近开始收细胞要跑磷酸化的蛋白质
上一次做的时候发现 若先用PBS刮下细胞离心後再加lysis buffer
测蛋白质浓度时 蛋白质的量非常的少
因为要做time course的实验
所以收下来的细胞泡在PBS里的时间比较长
所以我在想是不是因为这样 所以蛋白质被分解掉了
所以想请问大大们
如果我直接加lysis buffer的话
要加多少的量下去刮呢?
或者是有其他更好的方法呢?
谢谢!!!
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※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 192.192.90.33
1F：推 veltine:以我的经验而言，time course一到，就会把dish放在冰上， 08/29 16:41
2F：→ veltine:吸掉medium，用PBS wash两次，之後再加入30-50μl的lysis 08/29 16:42
3F：→ veltine:buffer，而我用的dish是35mm的…细胞数有点忘了，但是够跑 08/29 16:44
4F：→ veltine:WB至少两次(一次20μg)… 08/29 16:45
5F：→ veltine:但是你先用PBS刮下细胞离心後再加lysis buffer…有可能在 08/29 16:46
6F：→ veltine:你刮下细胞的同时就把细胞给打破了，而protein跑到PBS， 08/29 16:48
7F：→ veltine:这样子的话测出来的浓度就很少了，或者是你的treatment会 08/29 16:48
8F：→ veltine:会使细胞死亡，protein的量也会减少… 08/29 16:49
9F：→ veltine:事实上，在你用PBS wash细胞，再吸掉的同时，不会完全的吸 08/29 16:51
10F：→ veltine:PBS，所以当你再加入lysis buffer的量，就要考虑一下了… 08/29 16:52
11F：推 blence:很多lab都刮下後wash完再lyse,显然会lose是操作上差异造成 08/29 17:06
12F：→ blence:还有如果要考量残余PBS来斟酌lysis bu,不担心浓度不对吗？ 08/29 17:08
13F：推 veltine:呵呵…不过前实验室的做法是这样…也跑的出来… 08/29 17:20
14F：推 tsubasawolfy:treatment会造成细胞lose养多盘一点就解决了 08/29 17:21
15F：→ veltine:所以…我想这是结果论吧…假如能成功完成实验…就是好方法 08/29 17:21
16F：→ tsubasawolfy:我养４盘10cm dish还经过IP.磷酸蛋白一样可以侦测到 08/29 17:22
17F：→ veltine:考量残余PBS来斟酌lysis buffer，是指10mm dish残留量会高 08/29 17:22
18F：→ tsubasawolfy:不过这是OE蛋白 要侦测正常蛋白的磷酸会加到10盘 08/29 17:23
19F：→ veltine:些，所以要protein浓度高一些相对体积要少一些… 08/29 17:23
20F：→ tsubasawolfy:另外PBS是可以完全吸乾 wash时转到eppendorf再用 08/29 17:24
21F：→ veltine:不担心浓度不对？跑之前不是会测浓度吗？不太懂这个疑问… 08/29 17:24
22F：→ tsubasawolfy:suction抽乾就好 08/29 17:25
23F：→ tsubasawolfy:不过比较好奇做time course为何不立即加入lysis後再 08/29 17:27
24F：→ tsubasawolfy:冻到-80 还要泡在PBS理?? 这样不是会让细胞代谢继续? 08/29 17:27
25F：推 blence:回v,任何lysis bu都有配方浓度,在dish直接作用肯定会受PBS 08/29 17:33
26F：→ blence:大大影响salt,detergent浓度除非在tube才降低PBS影响至最低 08/29 17:35
27F：推 veltine:所以这就是实验啦~~黑猫白猫能捉到老鼠的就是好猫~~呵呵 08/29 17:38
28F：→ blence:至於t提到磷酸化,一般商业化P抗体要是这样,可能很难卖出去 08/29 17:39
29F：推 tsubasawolfy:XD 10盘量是因为本身seeding时有控制数目 药物处理後 08/29 17:47
30F：→ tsubasawolfy:又纯收贴附细胞 外加要求一次sample至少可以跑三次 08/29 17:47
31F：→ tsubasawolfy:实验条件case by case 08/29 17:48
32F：推 blence:除非做IP-mass spec,如果做w还要用这麽多盘,真的建议你找代 08/29 20:37
33F：→ blence:理商求技术支援,或藉以询问用过此磷抗的lab,不然这太可怜了 08/29 20:39
34F：推 tsubasawolfy:是w->mass没错- -a 08/29 21:09
35F：→ tsubasawolfy:另外我局的protein多收有益无害吧? 一次就压出来总 08/29 21:10
36F：→ tsubasawolfy:每次都拿一咪咪试不出来好 08/29 21:11
37F：推 stephennext:可以加到60 ml, 快满但是不会满出来 08/30 00:19
38F：推 LIAR:各位高手，能用回文的方式吗？t和v两人竟然还一行夹一行... 08/30 23:56