作者veltine (Time go by~~~)
看板Biotech
標題Re: [求救] 分段cloning
時間Fri Aug 29 02:04:07 2008
我之前也是要將一段gene clone (636bp)出來
: 再和一段140bp的promoter 及 310bp的terminator接起來
: 那時用的方式是overlap PCR 但最後會有其他雜band
: 改變許多方式 但定序後都不是完整的整段序列
: 所以最後改為 直接將兩片段ligation 連接成整段1kb大小再塞進TA
: 以下是圖示
: 776bp
: PciI-promoter--gene---KpnI
: KpnI--terminator-PciI
: 310bp
: 室溫下ligation 3h, 1:3比例
: 最後有成功將776和310片段接起來再挖膠 末端加A 之後送進TA
: 雖然步驟繁瑣轉且形效率很低(6顆 colony 0rz) 但命中率高
: 因為之前試了PCR直接P 是比較快 但是都有雜ban插入TA 必須篩出正確的
: 改用這個方法 終於成功接入TA 且序列正確
Great！之前提到的方法，居然有人試過…呵呵…太好了…
謝謝voen大的經驗分享…
另外想請教兩個問題：
Q1：在ligation中的比例是1:3，大片段是1而小片段是3嗎？
Q2：而你提述的把成功ligation的片段，從gel切下來，之後在
片段後面加A！請問用什麼enzyme才能辦的到？
假如不加A，直接再做PCR一次，再送進TA，效率會不會比較好？
感謝…
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◆ From: 91.3.165.60
1F：推 yaliu:加A Tag就辦的到了 他也是種DNA polymerase 08/29 02:54
2F：→ sGoat:加dATP,Taq,產物一起作用30分鐘,溫度好像是70 08/29 13:53
3F：推 voen:嗯嗯 是的1是大片段 3是小片段 或許你可同時是其他比例 08/29 15:18