作者veltine (Time go by~~~)
看板Biotech
标题Re: [求救] 分段cloning
时间Fri Aug 29 02:04:07 2008
我之前也是要将一段gene clone (636bp)出来
: 再和一段140bp的promoter 及 310bp的terminator接起来
: 那时用的方式是overlap PCR 但最後会有其他杂band
: 改变许多方式 但定序後都不是完整的整段序列
: 所以最後改为 直接将两片段ligation 连接成整段1kb大小再塞进TA
: 以下是图示
: 776bp
: PciI-promoter--gene---KpnI
: KpnI--terminator-PciI
: 310bp
: 室温下ligation 3h, 1:3比例
: 最後有成功将776和310片段接起来再挖胶 末端加A 之後送进TA
: 虽然步骤繁琐转且形效率很低(6颗 colony 0rz) 但命中率高
: 因为之前试了PCR直接P 是比较快 但是都有杂ban插入TA 必须筛出正确的
: 改用这个方法 终於成功接入TA 且序列正确
Great！之前提到的方法，居然有人试过…呵呵…太好了…
谢谢voen大的经验分享…
另外想请教两个问题：
Q1：在ligation中的比例是1:3，大片段是1而小片段是3吗？
Q2：而你提述的把成功ligation的片段，从gel切下来，之後在
片段後面加A！请问用什麽enzyme才能办的到？
假如不加A，直接再做PCR一次，再送进TA，效率会不会比较好？
感谢…
--
※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 91.3.165.60
1F：推 yaliu:加A Tag就办的到了 他也是种DNA polymerase 08/29 02:54
2F：→ sGoat:加dATP,Taq,产物一起作用30分钟,温度好像是70 08/29 13:53
3F：推 voen:嗯嗯 是的1是大片段 3是小片段 或许你可同时是其他比例 08/29 15:18