※ 引述《veltine (Time go by~~~)》之銘言： : ※ 引述《sGoat (無三小羚羊)》之銘言： : : 先無差別clone起來再去做Rapid Screen,挑出你要的3.5K的clone來做... : 我是用Advantage 2 Polymerase號稱可以PCR出13kb！ : 用Pfu P完直接ligation是接不起來的歐... : 因為PCR product沒有多一個A…對了為啥會多一個A啊？ : : 1.將你步驟一PCR出來的3.5K片段clone進T-A cloning vector... : : 挑出來之後純化 > 用你設計的酵素double digestion > 酒精沉澱,回溶 : : 2.將你的vector以你要的酵素做double digestion > 酒精沉澱,回溶 : : 3.算好molar ratio後將1.2.加在一起ligation : : 便宜簡單又不用check正反接 : 是的，其它的gene我也是用這種方法接上去的… : 非常的簡單，但是TA vector有點貴…Orz : 為什麼想分段cloning，主要原因是我的PCR有很多band，雖然直接 : 把3.5kb的gel切下來做cloning，但是定序完之後並不是我想要的 : gene…Orz : : 因為你Tm要是設太高primer跟template已經是若即若離了 : : 太嚴苛的條件是P不出來的... : : 太長時間擴增,長時間高溫也是不好... : 其實我都P的出來，主要是gel上非專一性的band很多… : 太長時間擴增…一般我都跑到30個cycl… : 感謝大家的回答 我之前也是要將一段gene clone (636bp)出來 再和一段140bp的promoter 及 310bp的terminator接起來 那時用的方式是overlap PCR 但最後會有其他雜band 改變許多方式 但定序後都不是完整的整段序列 所以最後改為 直接將兩片段ligation 連接成整段1kb大小再塞進TA 以下是圖示 776bp PciI-promoter--gene---KpnI KpnI--terminator-PciI 310bp 室溫下ligation 3h, 1:3比例 最後有成功將776和310片段接起來再挖膠 末端加A 之後送進TA 雖然步驟繁瑣轉且形效率很低(6顆 colony 0rz) 但命中率高 因為之前試了PCR直接P 是比較快 但是都有雜ban插入TA 必須篩出正確的 改用這個方法 終於成功接入TA 且序列正確 -- 不要小看自己 因人有無限可能 --

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