※ 引述《veltine (Time go by~~~)》之铭言： : ※ 引述《sGoat (无三小羚羊)》之铭言： : : 先无差别clone起来再去做Rapid Screen,挑出你要的3.5K的clone来做... : 我是用Advantage 2 Polymerase号称可以PCR出13kb！ : 用Pfu P完直接ligation是接不起来的欧... : 因为PCR product没有多一个A…对了为啥会多一个A啊？ : : 1.将你步骤一PCR出来的3.5K片段clone进T-A cloning vector... : : 挑出来之後纯化 > 用你设计的酵素double digestion > 酒精沉淀,回溶 : : 2.将你的vector以你要的酵素做double digestion > 酒精沉淀,回溶 : : 3.算好molar ratio後将1.2.加在一起ligation : : 便宜简单又不用check正反接 : 是的，其它的gene我也是用这种方法接上去的… : 非常的简单，但是TA vector有点贵…Orz : 为什麽想分段cloning，主要原因是我的PCR有很多band，虽然直接 : 把3.5kb的gel切下来做cloning，但是定序完之後并不是我想要的 : gene…Orz : : 因为你Tm要是设太高primer跟template已经是若即若离了 : : 太严苛的条件是P不出来的... : : 太长时间扩增,长时间高温也是不好... : 其实我都P的出来，主要是gel上非专一性的band很多… : 太长时间扩增…一般我都跑到30个cycl… : 感谢大家的回答 我之前也是要将一段gene clone (636bp)出来 再和一段140bp的promoter 及 310bp的terminator接起来 那时用的方式是overlap PCR 但最後会有其他杂band 改变许多方式 但定序後都不是完整的整段序列 所以最後改为 直接将两片段ligation 连接成整段1kb大小再塞进TA 以下是图示 776bp PciI-promoter--gene---KpnI KpnI--terminator-PciI 310bp 室温下ligation 3h, 1:3比例 最後有成功将776和310片段接起来再挖胶 末端加A 之後送进TA 虽然步骤繁琐转且形效率很低(6颗 colony 0rz) 但命中率高 因为之前试了PCR直接P 是比较快 但是都有杂ban插入TA 必须筛出正确的 改用这个方法 终於成功接入TA 且序列正确 -- 不要小看自己 因人有无限可能 --

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