作者jsi (jsi)
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標題Re: [求救] 轉RT所加的DTT的功用
時間Fri Aug 29 00:12:35 2008
※ 引述《SIH0209 (River)》之銘言：
請問大家
在做RT-PCR時
轉RT所加的DTT是有什麼功用?
1F：→ handoluslash:打開二級結構，使RNA二級結構較少` 08/28 01:01
2F：推 ookubo:DTT是常用的還原劑吧? 延遲酵素活性降低的功能...打開2級 08/28 10:15
3F：→ ookubo:結構一般不都是高溫處理，在瞬間冷卻就好了?? 08/28 10:15
4F：→ ookubo:一般RT都是40-42度C在作用，這也是SSIII效果好的原因之一， 08/28 10:16
5F：→ ookubo:因為它可以用50度C作用，減少一些二級結構的干擾。 08/28 10:17
6F：推 ookubo:^^我是為了應付愛問問題的學妹看書學的，也不一定全對... 08/28 14:08
7F：→ ookubo:有錯請不吝指正... 08/28 14:09
8F：推 dankai:ha大說的也應該也是一個原因~呵...之前我們上課有說過! 08/28 14:12
9F：推 ookubo:那...可以簡略講解一下DTT打開2級結構的機制嗎？ 謝謝囉 08/28 19:01
看到這問題我第一個想到的答案跟handoluslash一樣
我的想法是認為DTT和2-ME具有相同功能，可還原雙硫鍵。
由於這個特性，DTT可用於解開thiolated DNA所形成的dimers結構，
因此推測DTT用在RT步驟，是要解開RNA的二級結構。
不過，有網友說，mRNA不具雙硫鍵。
http://www.protocol-online.org/biology-forums/posts/4770.html
(But normally there is no disulfide bond in the mRNAs.)
所以看起來我這個推論，應該是不成立的。
後來看到ookubo的想法，發現我從未考慮到RT酵素活性這一點。
我感到有興趣的是，DTT常用來造成蛋白質變性。
至於它用在延遲酵素活性降低的功能是常見的嗎?
是否在酵素動力學實驗中也會添加DTT呢?
剛剛google發現了第三種說法
http://www.5ibio.com/html/RNA/RNAi/20071018/12918.html
最常用的RNA酶抑制剂Human Placental ribonuclease inhibitor（HPRI）是一种蛋白质
，可与多种RNA酶（包括RNases A, B, C类）非共价结合成为等摩尔复合物，抑制RNA酶活
性。HPRI需要在DTT存在的条件下保持最大活性。
http://www.promega.com/pnotes/61/6222_30/6222_30_core.pdf
顯示某些RNase inhibitor需在DTT存在下作用。
http://0rz.tw/d84Hi
Although RNaseOUT™ requires DTT to be active, it is stable if added to a DTT
free buffer and used immediately. If the RNaseOUT™ is diluted in the absence
of DTT, and held for any period of time it's activity will suffer.
http://www.ambion.com/techlib/resources/superasein/
Figure 3.說明某些RNase inhibitor需在DTT存在下才有較好的作用效果。
當然就會有廠商推出標榜不用DTT，依然很厲害的RNase inhibitor。
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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 61.62.20.55
10F：推 ookubo:對喔~忘記去咕狗一下~~感謝!! 08/29 03:05
11F：推 ookubo:咕狗完，發現配合RNase inhibitor的說法似乎比較多篇... 08/29 07:04
12F：→ ookubo:看來，很多東西當初在Lab學的時候，答案並非唯一正確... 08/29 07:05
13F：→ ookubo:學長姐的話，有時候不能全信，科學果然是要"探討"的... 08/29 07:05
14F：推 SIH0209:感謝 ^^ 08/29 09:12
15F：推 zoom8080:挖 又學到一項~~~ 08/29 11:06