作者jsi (jsi)
看板Biotech
标题Re: [求救] 转RT所加的DTT的功用
时间Fri Aug 29 00:12:35 2008
※ 引述《SIH0209 (River)》之铭言：
请问大家
在做RT-PCR时
转RT所加的DTT是有什麽功用?
1F：→ handoluslash:打开二级结构，使RNA二级结构较少` 08/28 01:01
2F：推 ookubo:DTT是常用的还原剂吧? 延迟酵素活性降低的功能...打开2级 08/28 10:15
3F：→ ookubo:结构一般不都是高温处理，在瞬间冷却就好了?? 08/28 10:15
4F：→ ookubo:一般RT都是40-42度C在作用，这也是SSIII效果好的原因之一， 08/28 10:16
5F：→ ookubo:因为它可以用50度C作用，减少一些二级结构的干扰。 08/28 10:17
6F：推 ookubo:^^我是为了应付爱问问题的学妹看书学的，也不一定全对... 08/28 14:08
7F：→ ookubo:有错请不吝指正... 08/28 14:09
8F：推 dankai:ha大说的也应该也是一个原因~呵...之前我们上课有说过! 08/28 14:12
9F：推 ookubo:那...可以简略讲解一下DTT打开2级结构的机制吗？ 谢谢罗 08/28 19:01
看到这问题我第一个想到的答案跟handoluslash一样
我的想法是认为DTT和2-ME具有相同功能，可还原双硫键。
由於这个特性，DTT可用於解开thiolated DNA所形成的dimers结构，
因此推测DTT用在RT步骤，是要解开RNA的二级结构。
不过，有网友说，mRNA不具双硫键。
http://www.protocol-online.org/biology-forums/posts/4770.html
(But normally there is no disulfide bond in the mRNAs.)
所以看起来我这个推论，应该是不成立的。
後来看到ookubo的想法，发现我从未考虑到RT酵素活性这一点。
我感到有兴趣的是，DTT常用来造成蛋白质变性。
至於它用在延迟酵素活性降低的功能是常见的吗?
是否在酵素动力学实验中也会添加DTT呢?
刚刚google发现了第三种说法
http://www.5ibio.com/html/RNA/RNAi/20071018/12918.html
最常用的RNA酶抑制剂Human Placental ribonuclease inhibitor（HPRI）是一种蛋白质
，可与多种RNA酶（包括RNases A, B, C类）非共价结合成为等摩尔复合物，抑制RNA酶活
性。HPRI需要在DTT存在的条件下保持最大活性。
http://www.promega.com/pnotes/61/6222_30/6222_30_core.pdf
显示某些RNase inhibitor需在DTT存在下作用。
http://0rz.tw/d84Hi
Although RNaseOUT™ requires DTT to be active, it is stable if added to a DTT
free buffer and used immediately. If the RNaseOUT™ is diluted in the absence
of DTT, and held for any period of time it's activity will suffer.
http://www.ambion.com/techlib/resources/superasein/
Figure 3.说明某些RNase inhibitor需在DTT存在下才有较好的作用效果。
当然就会有厂商推出标榜不用DTT，依然很厉害的RNase inhibitor。
--
※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 61.62.20.55
10F：推 ookubo:对喔~忘记去咕狗一下~~感谢!! 08/29 03:05
11F：推 ookubo:咕狗完，发现配合RNase inhibitor的说法似乎比较多篇... 08/29 07:04
12F：→ ookubo:看来，很多东西当初在Lab学的时候，答案并非唯一正确... 08/29 07:05
13F：→ ookubo:学长姐的话，有时候不能全信，科学果然是要"探讨"的... 08/29 07:05
14F：推 SIH0209:感谢 ^^ 08/29 09:12
15F：推 zoom8080:挖 又学到一项~~~ 08/29 11:06