※ 引述《veltine (Time go by~~~)》之銘言： : 已經卡很久的cloning…Orz : 小弟正在clone一個3.5kb的轉錄因子… : 由於primer專一性不夠高，所以想分段clone… : 之後再接起來…因為沒有分段clone再接起來的經驗… : 所以請問大家… : Q1：整個序列為3.5kb，要把它拆成多大進行clone呢？ : 如1.7kb和1.8kb兩段或是1kb、1kb、1.5kb… : Q2：PCR之後，直接切PCR產物，之後liagation，再 : subclone到我的vector上，還是先接上某一個 : 片段到vector上，再接另一個片段？請問那一種 : 方法比較好？ : 感謝大家… 3.5kb說大不大、說小也不小… 這個gene在我手上就是clone不出來…Orz 提到primer專一性不夠的原因，我的primer設計出來有33-35mer (含有酵素切位)，我也blast primer在NCBI上，確時是會有blast 到genomic DNA，但是我的total RNA已經用DNase I處理過，PCR 出來還是有很band…而且在1kb的位置特別亮… 想問的問題是要怎麼提高我的primer專一性，長度夠、GC%也正常 在47和50%、Tm為72和76…還有那個地方要注意的嗎？ 另外，我的第二個問題，為什麼會這麼問，是因為牽涉到primer設 計上考量，假如是先接好我要的gene，這樣子primer酵素切位的設 計上，就簡單多了，問題是non-circular的片段可以用ligase接起 來嗎？ 假如先接上某一片段，primer酵素切位的設計上就很傷腦筋了… 由於我用的vector是自己做的，切位由5'開始，只有NheI、PacI 、PmeI和NsiI可以用… 舉列來說： NheI---1.7kb---NsiI NisI---1.8kb---NsiI 先接上1.7kb到vector，之後再接上1.8kb…不過還要再check是正 接還是反接…Orz 我想到的分段接的primer酵素切位只有這個，還有其它的方法嗎？ 話說回來，有個gene約1.5kb，primer Tm為72和82，我用52℃就 可以得到single band…哎…cloning真是很神奇的實驗…Orz --

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