※ 引述《veltine (Time go by~~~)》之铭言： : 已经卡很久的cloning…Orz : 小弟正在clone一个3.5kb的转录因子… : 由於primer专一性不够高，所以想分段clone… : 之後再接起来…因为没有分段clone再接起来的经验… : 所以请问大家… : Q1：整个序列为3.5kb，要把它拆成多大进行clone呢？ : 如1.7kb和1.8kb两段或是1kb、1kb、1.5kb… : Q2：PCR之後，直接切PCR产物，之後liagation，再 : subclone到我的vector上，还是先接上某一个 : 片段到vector上，再接另一个片段？请问那一种 : 方法比较好？ : 感谢大家… 3.5kb说大不大、说小也不小… 这个gene在我手上就是clone不出来…Orz 提到primer专一性不够的原因，我的primer设计出来有33-35mer (含有酵素切位)，我也blast primer在NCBI上，确时是会有blast 到genomic DNA，但是我的total RNA已经用DNase I处理过，PCR 出来还是有很band…而且在1kb的位置特别亮… 想问的问题是要怎麽提高我的primer专一性，长度够、GC%也正常 在47和50%、Tm为72和76…还有那个地方要注意的吗？ 另外，我的第二个问题，为什麽会这麽问，是因为牵涉到primer设 计上考量，假如是先接好我要的gene，这样子primer酵素切位的设 计上，就简单多了，问题是non-circular的片段可以用ligase接起 来吗？ 假如先接上某一片段，primer酵素切位的设计上就很伤脑筋了… 由於我用的vector是自己做的，切位由5'开始，只有NheI、PacI 、PmeI和NsiI可以用… 举列来说： NheI---1.7kb---NsiI NisI---1.8kb---NsiI 先接上1.7kb到vector，之後再接上1.8kb…不过还要再check是正 接还是反接…Orz 我想到的分段接的primer酵素切位只有这个，还有其它的方法吗？ 话说回来，有个gene约1.5kb，primer Tm为72和82，我用52℃就 可以得到single band…哎…cloning真是很神奇的实验…Orz --

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