※ 引述《lainhat (下一個天亮...)》之銘言： : 小弟我做ligation做很久了 : 也看過很多舊文了 : 但是有沒有接起來 到現在還是得靠運氣 基本上以我有作過的方面回答,缺的部分就請其他有經驗的人補足吧... : 不同比例(測濃度算莫爾數) 1:3~3:1 到 1:5~5:1就我的經驗來說是沒有太大的差別的 (使用過的Vector為P-GEM T Easy以及PET-29) : 不同總體積(5ul 10ul 20ul 25ul) 這部分最好將insert量提高,而且總體積縮小... 用以增加它接的機率... : 不同方式去接(gateway 和 傳統接法) : 不同transform法(電穿孔 和 熱休克) 使用DH5a以及BL-21兩種菌株皆以Heat shock方式... : 不同ligase(NEB 和 Promega) 使用過promega以及其他台製ligase... 注意buffer保存良好就鮮少有接不起來的情形... (T-A cloning以及blunt-ended PCR產物加上A後的ligation,以及Double digestion) : 不同菌液量塗盤(200ul 和 濃縮) 這點就看個人,基本上菌落密度以挑菌方便為主... 不過有長最實在,沒長的話這一點影響力都沒有... : 不同菌株(XL1-blue 和 Top10) 這以實驗設計為主,菌株的選擇當然是好養又好用為優先... 除非載體特別,不然都是以這為取向... : 不同方式純化DNA(kit回收 或 軟膠回收) 使用Q牌miniprep作DNA回收以及Q牌膠體回收kit... 注意膠體回收會有產物lost以及後續ligation的問題... 最常見的問題就是接不起來,所以要是酵素剪切之後的片段占有80%以上... 而且剪切完的條帶相當清晰的話,我會偏向以phenol/chloroform > 酒精沉澱 的方式回收總剪切產物,算好比例之後直接拿去ligation... 有接出來再去篩片段總比沒接出來有用得多... 另外Q牌miniprep回收片段大小不同有不同方式,請參閱說明書... Q牌膠體回收也有2%以下的限制,超過的話請參閱說明書... : 不同條件去電菌(伏特 電阻 電容) : 不同時間去熱休克(30" 60" 90" 120" 150" 180") 42度兩分鐘,competent cell加入ligation完的產物後輕輕以tip mix即可... : 不同培養基去養菌 與選擇菌種有關,注意營養缺乏以及抗生素使用即可... 以上算是最基礎的分生實驗室會用到的東西與步驟... 歡迎補完... --

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