※ 引述《lainhat (下一个天亮...)》之铭言： : 小弟我做ligation做很久了 : 也看过很多旧文了 : 但是有没有接起来 到现在还是得靠运气 基本上以我有作过的方面回答,缺的部分就请其他有经验的人补足吧... : 不同比例(测浓度算莫尔数) 1:3~3:1 到 1:5~5:1就我的经验来说是没有太大的差别的 (使用过的Vector为P-GEM T Easy以及PET-29) : 不同总体积(5ul 10ul 20ul 25ul) 这部分最好将insert量提高,而且总体积缩小... 用以增加它接的机率... : 不同方式去接(gateway 和 传统接法) : 不同transform法(电穿孔 和 热休克) 使用DH5a以及BL-21两种菌株皆以Heat shock方式... : 不同ligase(NEB 和 Promega) 使用过promega以及其他台制ligase... 注意buffer保存良好就鲜少有接不起来的情形... (T-A cloning以及blunt-ended PCR产物加上A後的ligation,以及Double digestion) : 不同菌液量涂盘(200ul 和 浓缩) 这点就看个人,基本上菌落密度以挑菌方便为主... 不过有长最实在,没长的话这一点影响力都没有... : 不同菌株(XL1-blue 和 Top10) 这以实验设计为主,菌株的选择当然是好养又好用为优先... 除非载体特别,不然都是以这为取向... : 不同方式纯化DNA(kit回收 或 软胶回收) 使用Q牌miniprep作DNA回收以及Q牌胶体回收kit... 注意胶体回收会有产物lost以及後续ligation的问题... 最常见的问题就是接不起来,所以要是酵素剪切之後的片段占有80%以上... 而且剪切完的条带相当清晰的话,我会偏向以phenol/chloroform > 酒精沉淀 的方式回收总剪切产物,算好比例之後直接拿去ligation... 有接出来再去筛片段总比没接出来有用得多... 另外Q牌miniprep回收片段大小不同有不同方式,请参阅说明书... Q牌胶体回收也有2%以下的限制,超过的话请参阅说明书... : 不同条件去电菌(伏特 电阻 电容) : 不同时间去热休克(30" 60" 90" 120" 150" 180") 42度两分钟,competent cell加入ligation完的产物後轻轻以tip mix即可... : 不同培养基去养菌 与选择菌种有关,注意营养缺乏以及抗生素使用即可... 以上算是最基础的分生实验室会用到的东西与步骤... 欢迎补完... --

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