作者dudu0623 (貓精)
看板Biotech
標題[求救] co-ip 有許多雜band
時間Wed Aug 20 16:21:09 2008
我所要作的target protein位置約為52 kDa，與heavy chain的位置很近，
所以我使用去除heavy chain 的mouse和 rabbit的HRP 二抗(騰達行 公司)作WB的部分，
在經過抗體測試後，抗體的確是辨認 light chain 28 kDa 的位置，
而heavy chain的訊號很微弱。
但是問題來了，當我加入cell lysate後，用同樣的protocol作，
連pre-immune的 IgG部分，從55 kDa的位置以下都有許多雜band，當然，
我的實驗組也產生同樣的結果，完全沒有辦法辨識是否有抓到我的target protein。
在這邊我附上我的實驗方式:
protein conc 約0.5 mg
抗體 conc 1μg
RIPA buffer
50 mM tris-HCL
0.1% NP-40
150mM NaCl
2mM DTT
1% triton X-100
ip 培養時間 1 hr 4度C
清洗次數 5次
WB 的一抗稀釋倍數 1000x
希望有作過IP 的前輩，給我幫助吧!!!!^^
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◆ From: 203.64.81.124
1F：推 ligase:是不是protein degradation?加一些proteinase inhibitor 08/21 00:56
2F：→ ligase:在lysis buffer內吧,必要時連wash buffer也要加 08/21 00:56
3F：→ dudu0623:謝謝~~我會試試看 08/21 20:56