※ 引述《owl628 (owl628)》之銘言： : 最近學用DIG合成probe去做Southern : 但是壓出來的結果有很多雜band : 而且major band並不是我要的band : 想了一下如何降低background : 想到 : 1.增加probe長度(原本是500bp) : 2.增加pre-hybridation的時間(原本是一小時) : 3.增加wash的時間跟溫度 : 註:上述條件大部分是照Roche的kit做的 : 想說板上有沒有人有類似的問題 : 不知道除了我舉的那三點還有沒有哪裡可以改進 : 或是那三點改進有用嗎??? : 麻煩大家了,謝謝~ 首先 southern 真的是超難做的實驗, 好吧 其實是繁瑣 正沖我的急躁 過程是重重考驗~ 科科 ~ 所以第一個建議是.....別急...一步步紮紮實實往下作 -------------------------------------- 實驗部分: 1. 南方轉漬 要注意的有 a. DIG labeling band shift是不是有符合預期,DIG-dU的比例 (PCR法) 如果吃飽太閒有人甚至還會純化過 科科 b. DNA的脢切~影響脢切的因素有沒有排除, 切完之後的 DNA ladder...等等 c. 架鹽橋之前的buffer wash ..... 淦 I hate those so much. (切記...用那種membrane就根據原廠建議的buffer濃度) 以上請自行確認~並小心操作 -------------------------------------- 根據您的敘述 我認為 背景值除非深到影響判讀~ 否則....跟結果不符預期是兩回事 背景太深...跟probe長度 或 pre-hy時間 我認為 無關 跟 probe loading 的量, wash的條件,與曝光時間長短 有關 probe 該下多少 請參考羅氏說明書<<<<大本的那種,上頭好像還有隻青蛙照片 該用怎樣的條件wash, molecular cloning 有寫 曝光 就交給機器吧~ 我是用CCD偵測+電腦控制>>data 是 jpg or tif 所以我都放心的出去玩 科科 至於與結果不符預期~我認為... 如果不是DNA沒切好 大概是..................anyway...就在重頭推算一次 搜尋一下probe的敘列 搞不好 probe內含一段太過於保守的片段 以致亂粘 可能您後來會嚇一跳 目前的結果 其實是*可以 符合預期的* 所以~ 雖然我認為500bp 應該是夠了~ 但是probe搞長點~應該也不賴 總之再次確認之後 您自然會有所取捨 --

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